基本信息
- 項目名稱：
- Construction of pcDNA3-CIRP and pECFP-C1-CIRP and
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術(shù)論文
- 簡介：
- 構(gòu)建冷誘導RNA結(jié)合蛋白（cold inducible RNA binding protein ,CIRP）的兩個重組質(zhì)粒pcDNA3-CIRP 和pECFP-C1-CIRP，將其轉(zhuǎn)入NIH3T3 細胞并成功實現(xiàn)真核表達。篩選獲得pECFP-C1-CIRP穩(wěn)定表達的NIH3T3 細胞株，熒光顯微鏡觀察綠色熒光主要分布于細胞質(zhì)和細胞外，冷誘導凋亡實驗提示CIRP在保護細胞免受冷凋亡中具有重要作用。
- 詳細介紹：
- 冷應激是生物機體適應低溫的生理性反應。如果寒冷刺激對細胞的損傷作用超過了修復能力，則誘導細胞發(fā)生凋亡或壞死。動物都是通過啟動與抗冷性有關的基因和表達,給出逆境保護措施,從而協(xié)助動物度過難關或逆境的?，F(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn),抗冷能力與動物基因組中抗凍蛋白基因的拷貝個數(shù)成正比。構(gòu)建冷誘導RNA結(jié)合蛋白（cold inducible RNA binding protein ,CIRP）是冷應急反應中一個重要的保護性蛋白。本研究從冷處理后的BALB/C小鼠睪丸組織中提取總RNA，通過RT-PCR擴增CIRP的cDNA，構(gòu)建重組入真核表達載體pcDNA3 和pECFP-C1，通過酶切鑒定篩選出陽性重組菌；利用脂質(zhì)體法將2種重組質(zhì)粒pcDNA3-CIRP 和pECFP-C1-CIRP以及空白對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NIH3T3 細胞, 36h 后熒光倒置顯微鏡及RT-PCR方法觀察及鑒定CIRP在細胞中的表達情況，結(jié)果表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確并獲得了表達；同時對pECFP-C1-CIRP 轉(zhuǎn)染組進行G418加壓篩選，熒光顯微鏡觀察所有細胞均呈現(xiàn)較強綠色熒光，表明成功篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞株，而綠色熒光主要分布于細胞質(zhì)和細胞外，說明隨著加壓篩選CIRP 融合蛋白被分泌出細胞外；最后將轉(zhuǎn)染后的細胞于4℃、14℃、24℃ 條件下進行冷誘導凋亡實驗，經(jīng)Hoechst33258熒光染色法后，細胞凋亡熒光顯微鏡檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染CIRP基因的細胞組凋亡程度小于對照組，在保護細胞免受冷凋亡過程中具有重要作用。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究為探究冷誘導RNA 結(jié)合蛋白CIRP是否具有對抗冷誘導的細胞凋亡的生物保護功能。首先構(gòu)建CIRP的兩個真核表達載體，在真核細胞內(nèi)實現(xiàn)CIRP的成功過表達。然后對比能夠穩(wěn)定表達CIRP的細胞株與轉(zhuǎn)染空載體細胞株株以及野生株在冷刺激條件下的凋亡率，驗證CIRP是否具有保護細胞免受冷誘導的凋亡損傷的作用。
科學性、先進性及獨特之處
- 冷誘導RNA 結(jié)合蛋白CIRP被鑒定出來之后多應用于腫瘤、紫外線應激、缺氧缺血應激以及冬眠和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等多方面的研究，并得到大量的證據(jù)證明CIRP是多功能的保護性蛋白。但是國內(nèi)外還未曾有資料報道這個在冷的條件下被大量誘導的蛋白對冷刺激自身所導致的凋亡是否具有抵抗作用。本研究首次提出并初步證明CIRP具有對抗冷誘導的細胞凋亡的作用。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 本論文開展有關冷誘導細胞凋亡以及用基因工程手段進行調(diào)控的研究對移植器官醫(yī)學領域具有重要的參考和應用價值，不僅有利于深入探討冷誘導細胞凋亡的分子機制，而且有利于尋求新的阻斷冷誘導細胞凋亡的方法。
學術(shù)論文摘要
- 本研究從冷處理后的BALB/C小鼠睪丸組織中提取總RNA，通過RT-PCR擴增CIRP的cDNA，構(gòu)建重組入真核表達載體pcDNA3 和pECFP-C1，通過酶切鑒定篩選出陽性重組菌；利用脂質(zhì)體法將2種重組質(zhì)粒pcDNA3-CIRP 和pECFP-C1-CIRP以及空白對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NIH3T3 細胞, 36h 后熒光倒置顯微鏡及RT-PCR方法觀察及鑒定CIRP在細胞中的表達情況，結(jié)果表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確并獲得了表達；同時對pECFP-C1-CIRP 轉(zhuǎn)染組進行G418加壓篩選，熒光顯微鏡觀察所有細胞均呈現(xiàn)較強綠色熒光，表明成功篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞株，而綠色熒光主要分布于細胞質(zhì)和細胞外，說明隨著加壓篩選CIRP 融合蛋白被分泌出細胞外；最后將轉(zhuǎn)染后的細胞于4℃、14℃、24℃ 條件下進行冷誘導凋亡實驗，經(jīng)Hoechst33258熒光染色法后，細胞凋亡熒光顯微鏡檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染CIRP基因的細胞組凋亡程度小于對照組，在保護細胞免受冷凋亡過程中具有重要作用。
獲獎情況
- 該研究的前期工作曾在中國畜牧獸醫(yī)學會動物生理生化學分會第9次和第10次（廣州、昆明）學術(shù)會議上進行專題報告，同時在中國生理學會東北三省生理學會（大連）進行報告。特別是該研究收到第36屆國際生理學大會邀請，于2009年7-8月在日本京都召開的第36屆國際生理學大會進行墻報展示和交流，得到世界生理學界學術(shù)同仁的認可與好評。該研究的前期工作基礎曾在《Journal Agricultural Science and Technology USA》，《生理科學進展》等國內(nèi)外期刊發(fā)表學術(shù)論文近10篇。其中“BALB/C鼠睪丸組織中冷誘導RNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆與序列分析”，獲2009年大慶市第23屆自然科學技術(shù)成果（論文類）三等獎，“Cloning and Sequence Analysis of Cold Inducible RNA-binding Protein cDNA from Testis Tissue in BALB/C Mice”獲2010年第11屆黑龍江省自然科學技術(shù)成果（論文類）三等獎。 目前，該論文正在接受《Journal of Biomedical Science and Engineering》雜志的專家評審，即將在線全文發(fā)表。
鑒定結(jié)果
- 此項未填
參考文獻
- [1] Peng Y, Yang PH, Tanner JA, Huang JD, Li M, Lee HF, Xu RH, Kung HF, Lin MC. (2006) Cold-inducible RNA binding protein is required for the expression of adhesion molecules and embryonic cell movement in Xenopus laevis. Biochem Biophys Res Commun 344:416-424. [2] Sakurai T, Itoh K, Higashitsuji H, Nonoguchi K, Liu Y, Watanabe H, Nakano T, Fukumoto M, Chiba T, Fujita J. (2006) Cirp protects against tumor necrosis factor-α-induced apoptosis via activation of extracellular signal-regulated kinase. Biochim Biophys Acta 1763:290–295. [3] Sambrook J, Russell W. Molecular Cloning:A Laboratory manual. 3rd ed. Beijing:Science Press, (in chinese) (2002). [4] Wellmann S, Buhrer C, Moderegger E, Zelmer A, Kirschner R, Koehne P, Fujita J, Seeger K. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1 -independent mechanism. J. Cell Sci., 117:1785–1794 (2004).
同類課題研究水平概述
- 1997年Nishiyama H等[1]首次從小鼠睪丸細胞中分離了冷誘導RNA結(jié)合蛋白（Cold inducible RNA-binding protein, CIRP）的cDNA，具有介導冷誘導的細胞生長抑制作用。CIRP 在結(jié)構(gòu)上，它具有重要的RNA結(jié)合基序之一—RNP基序，可能參與基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)如mRNA剪接、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和多腺苷酸化[2]。在植物體中，許多屬于同一RNP家族的蛋白質(zhì)主要在分生組織和生長組織中表達，被推測與植物生長調(diào)節(jié)和外界刺激反應相關。在大腸桿菌內(nèi)，冷休克蛋白A是主要的冷休克蛋白之一，與低溫環(huán)境下的細胞生長和蛋白質(zhì)合成有關[3]。類似的是，低溫影響CIRP在動物細胞中的表達，介導以DNA合成前期延長為主要特征的哺乳動物細胞生長抑制，參與調(diào)節(jié)相關蛋白合成來到達自身保護的作用，這是細胞對低溫的一種適應性反應，對生物體生存具有重要意義[4]。 同時，CIRP也在其他多種哺乳動物小鼠、人類、大鼠、墨西哥美西螈、牛蛙、非洲爪蛙和鮭魚等細胞中被發(fā)現(xiàn)，但蛋白的細胞定位具有特異性，種屬不同蛋白的定位也有差異；CIRP在其他應激壓力下也能被誘導表達，如紫外線照射、高滲透壓和缺氧條件等[4,5,6]；CIRP參與許多生物學過程，發(fā)揮著不同的生物學功能，而不僅僅只參與人和動物冷應激過程，可以說它是一種重要的生物機體多功能蛋白。它可能會為揭示人和動物冷應激反應的調(diào)節(jié)機制提供一條線索[1,7]，可能會為闡明雄性不育癥的分子機制提供啟示[8]，可能調(diào)節(jié)兩棲動物冬眠活動[9]，可能參與正常子宮內(nèi)膜周期調(diào)節(jié)及其癌癥發(fā)生[10]；它參與人和動物神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)[11]以及非洲爪蟾和墨西哥美西螈胚胎發(fā)育過程[12,13]。 細胞凋亡(apoptosis)，又名細胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，是用來定義PCD 過程中一些共同的形態(tài)學特征, 通過細胞內(nèi)固有的生理生化反應或某種酶的活化而導致的細胞死亡。 Sakurai T等[14] 通過體外細胞實驗，分析在適度低溫條件下培養(yǎng)細胞和CIRP表達對細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)CIRP 能夠憑借激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑，防止腫瘤壞死因子α 誘導的細胞凋亡。寒冷刺激同樣能夠?qū)е录毎ぶ^氧化，細胞水腫，細胞膜彈性、通透性以及細胞內(nèi)各種細胞器形態(tài)發(fā)生改變，進而引起細胞凋亡。
