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基本信息
- 項目名稱：
- 血清中肝癌相關(guān)microRNA的穩(wěn)定性分析
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本課題通過研究MicroRNA的穩(wěn)定性，運用qRT-PCR方法分析比較正常人和肝癌患者相關(guān)microRNA的表達量，從而進一步研究其是否可作為潛在的檢測肝癌的生物標(biāo)記物。該方法深入到基因?qū)用?，具有特異性好，靈敏度高的優(yōu)點。此外本課題所研究的microRNA來自血清樣本，相比目前國內(nèi)外研究多著眼于組織樣本，具有清潔、無創(chuàng)傷性，且取樣方便、可連續(xù)檢測。
- 詳細(xì)介紹：
- 目前臨床上肝癌的檢測有影像學(xué)、蛋白標(biāo)志物、酶學(xué)標(biāo)志物，標(biāo)志物檢測的敏感性和特異性是決定其臨床價值的兩個重要因素，目前檢測肝癌的傳統(tǒng)方法為蛋白檢測技術(shù)和影像學(xué)技術(shù)，因存在局限性，確診多在晚期，導(dǎo)致治愈率低，死亡率高。本課題通過研究MicroRNA的穩(wěn)定性，運用qRT-PCR方法分析比較正常人和肝癌患者相關(guān)microRNA的表達量，從而進一步研究其是否可作為潛在的檢測肝癌的生物標(biāo)記物。該方法深入到基因?qū)用?，具有特異性好，靈敏度高的優(yōu)點。此外本課題所研究的microRNA來自血清樣本，相比目前國內(nèi)外研究多著眼于組織樣本，具有清潔、無創(chuàng)傷性，且取樣方便、可連續(xù)檢測。利用高通量實施熒光定量PCR技術(shù)系統(tǒng)篩選肝臟疾病患者血清中microRNA的表達變化，鑒定若干具有臨床意義的肝臟疾病診斷及早期檢測血清標(biāo)志物。本項目的實施在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用兩方面均具有重要的意義，不僅將提升我國在相關(guān)研究領(lǐng)域的水平，還將可能為臨床常見的肝損傷、肝炎和肝癌等重大疾病的診斷和治療提供新的、更加靈敏的檢測指標(biāo)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究通過對不同形態(tài)的肝癌相關(guān)樣本，包括肝癌Huh-7細(xì)胞系、臨床肝癌組織和血液樣本中的miRNA在不同條件下穩(wěn)定性的評價。本研究使用18S rRNA作為對照基因，7種由相關(guān)文獻報道的肝癌相關(guān)miRNAs為目的基因。在a）不同溫度下（-80℃，-20℃，4℃，室溫）放置3 h；b）在室溫下放置0、1、3、6、12和24 h等6種條件下處理后的樣本經(jīng)過40個循環(huán)的定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行測定。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 臨床上肝癌的檢測有影像學(xué)、蛋白標(biāo)志物、酶學(xué)標(biāo)志物，因存在局限性，確診多在晚期，導(dǎo)致治愈率低，死亡率高。本課題通過研究MicroRNA的穩(wěn)定性，運用qRT-PCR方法分析比較正常人和肝癌患者相關(guān)microRNA的表達量，進一步研究其是否可作為潛在檢測肝癌的生物標(biāo)記物。該方法具有特異性好，靈敏度高的優(yōu)點。所研究的microRNA來自血清樣本，清潔、無創(chuàng)傷性，且取樣方便、可連續(xù)檢測。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 血清作為生物檢測樣本，具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)體外檢測的優(yōu)點，而且血清miRNA的高度穩(wěn)定性也使得病人的實際值與實驗的測試值相當(dāng)?shù)奈呛希虼搜錷iRNA水平可作為癌癥或其它疾病的生物標(biāo)記物，為癌癥及其它疾病的診斷提供一種新的敏感、特異、簡單、非損傷性的臨床診斷技術(shù)，用于腫瘤分類、預(yù)后及療效預(yù)測、手術(shù)療效監(jiān)測及疾病復(fù)發(fā)預(yù)測等領(lǐng)域，并可能帶來未來臨床醫(yī)學(xué)上的變革。
學(xué)術(shù)論文摘要
- MicroRNA (miRNA) 是一類長度約22 nt的非編碼單鏈RNA，具有基因表達調(diào)控的功能。血清中miRNA可作為檢測各類癌癥與疾病的潛在生物標(biāo)記物，用于病人外周血癌癥的早期檢測與癌癥復(fù)發(fā)的檢測。因此，有必要系統(tǒng)研究癌癥相關(guān)血清中miRNA的穩(wěn)定性。 本研究的目的在于對不同形態(tài)的肝癌相關(guān)樣本，包括肝癌Huh-7細(xì)胞系、臨床肝癌組織和血液樣本中的miRNA在不同條件下穩(wěn)定性的評價。本研究使用18S rRNA作為對照基因，7種由相關(guān)文獻報道的肝癌相關(guān)miRNAs為目的基因在6種不同條件下進行處理。處理后的樣本經(jīng)過40個循環(huán)的定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行測定。結(jié)果顯示，在不同條件下肝癌相關(guān)miRNAs都有擴增，并且miRNA在極端苛刻的條件下能抵抗降解，保持穩(wěn)定。而核糖體RNA（rRNA）較為脆弱，其相對擴增量在非生理測試中急劇下降，較易降解。 綜上所述，肝癌相關(guān)miRNAs在血清中穩(wěn)定存在且能被檢測到；在同一物種不同個體的血清中重復(fù)性好；其表達量與性別不相關(guān)；能特異性區(qū)分肝癌血清與正常血清，可作為肝癌的潛在生物標(biāo)記物。 關(guān)鍵詞：miRNA；癌癥；穩(wěn)定性；血清；生物標(biāo)記物
獲獎情況
- 1 項目相關(guān)研究論文 金幼芳，徐根明，李艷，孟麗， 姜永厚，郭江峰，丁先鋒* (2011) 定量PCR檢測microRNA表達的數(shù)據(jù)歸一化新技術(shù). 生物化學(xué)與生物物理進展 2 項目相關(guān)發(fā)明專利申請 microRNA生物標(biāo)志物及其用途，申請?zhí)枺?01010220241.9 1； 申請人：浙江理工大學(xué)；發(fā)明人： 丁先鋒，郭江峰，李艷， 徐立堅，姚虎，呂佳嵐， 朱恒怡 3 承擔(dān)科研項目情況 項目名稱：卵巢癌血清miRNA的篩選及在早期診斷中的應(yīng)用意義 經(jīng)費來源：浙江省科技創(chuàng)新活動計劃（新苗人才計劃），1萬元 起止日期：2010.01-2011.03
鑒定結(jié)果
- 該課題具新穎性、創(chuàng)新性，完成較好，結(jié)果較好。所獲成果屬實。
參考文獻
- 1.Jiang Y, Shang H, Xu H, Ding X,Zhao L,Fang L,Chen W.Detection and genotyping of porcine circovirus in naturally infected pigs by oligo-microarray. Res Vet Sci.2010, 89(1):133-9. 2.金幼芳,徐根明,李艷,孟麗,姜永厚,郭江峰,丁先鋒.定量PCR檢測microRNA表達的數(shù)據(jù)歸一化新技術(shù). 生物化學(xué)與生物物理進展,2011. 3.李艷,苗杰,丁先鋒,許利堅,姚虎. Stability Analysis of Liver Cancer Related MicroRNAs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2010, 43(1) :69-78. 4.李艷,丁先鋒,苗杰.非編碼RNA檢測技術(shù)的研究進展. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2010,38(11)：5546-5548 5.Wang F,Zheng Z,Guo J and Ding X. Correlation and quantitation of microRNA aberrant expression in tissues and sera from patients with breast tumor. Gynecologic Oncology,2010,119(3):586-593. 6.丁佳女,張羽,丁先鋒,郭江峰. RNA在離體小鼠肝臟組織中的穩(wěn)定性.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2010,26(4): 581-585. 7.Fornari, F., L. Gramantieri, M. Ferracin, A. Veronese, S. Sabbioni, G.A. Calin, G.L. Grazi, C. Giovannini, C.M. Croce, L. Bolondi, M. Negrini. MiR-221 controls CDKN1C/p57 and CDKN1B/p27 expression in human hepatocellular carcinoma [J]. Oncogene, 2008, 27(43):5651-5661.
同類課題研究水平概述
- 目前，傳統(tǒng)的檢測肝癌方法主要是蛋白檢測技術(shù)和影像學(xué)技術(shù)，但由于其局限性導(dǎo)致肝癌確診多在晚期，治愈率低?；蛟\斷具有靈敏度高，特異性好的優(yōu)點。目前研究多研究組織樣本中的microRNA，本課題創(chuàng)新性的對血清樣本中的MicroRNA進行研究。通過文獻查詢及已有的實驗基礎(chǔ)，推測microRNA具有成為檢測肝癌的潛在生物標(biāo)記物，而其能穩(wěn)定存在是基本前提。因此有必要系統(tǒng)研究其穩(wěn)定性。本課題主要利用qRT-PCR方法，對3個不同樣本7條microRNA在6種不同條件處理下，進行穩(wěn)定性分析。 目前國內(nèi)外的相關(guān)文獻主要涉及：文獻1：肝癌異常表達microRNAs的鑒定、功能、作用靶點以及治療潛力研究，何星星，華中科技大學(xué)。其研究microRNAs的表達量變化；文獻2：肺癌95D與95C細(xì)胞株中轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs的篩選研究，周美玉，中南大學(xué)。其基于Trizol提取方法對血漿miRNA分離過程進行優(yōu)化；文獻3：大鼠肝癌細(xì)胞與胚胎肝細(xì)胞microRNA差異表達譜的研究，吳印濤，第四軍醫(yī)大學(xué)。使用miRNA芯片對不同轉(zhuǎn)移能力肺癌細(xì)胞株進行篩選以找到與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNAs；專利4：從人血清/血漿樣本中分離RNA方法及其PCR驗證法，丁先鋒，201010220261.6。.用TaqMan qRT-PCR確認(rèn)肝癌中異常表達的microRNAs并利用肝癌裸鼠移植瘤模型其治療潛力；專利5：microRNA生物標(biāo)記物及其用途，丁先鋒，李艷。microRNA生物標(biāo)記物用于制備具有肝癌檢測能力的試劑盒；論文6：血漿microRNA提取技術(shù)優(yōu)化，趙德堯，浙江理工大學(xué)學(xué)報。利用Trizol試劑從人血清/血漿樣本中分離RNA以有效獲得高質(zhì)量且含量高的RNA方法； 本課題比較了肝癌相關(guān)7種microRNAs在肝癌血清與健康血清中的表達量。發(fā)現(xiàn)該7種miRNAs能特異區(qū)分肝癌血清與正常血清，可用作肝癌的潛在生物標(biāo)志物。同時建立了一種高效的血清RNA分離方法——預(yù)加熱法，該方法可將樣本CT 值降低至少5個循環(huán)，有利于miRNA表達譜的研究和異常miRNA表達疾病預(yù)后的研究。 綜上所述，本課題“血清中肝癌相關(guān)microRNA的穩(wěn)定性分析”具有很好的新穎性。 本課題科技查新報告，請見附頁。
