基本信息
- 項目名稱：
- 擬南芥中百合花藥小熱激蛋白LimHSP16.45同源基因的克隆及其耐熱性和抗冷性研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 通過提取擬南芥中百合花藥小熱激蛋白LimHSP16.45同源基因AT-HSP17.6。將其導(dǎo)入大腸桿菌中，使其異源表達。之后在45℃高溫和4℃低溫脅迫下，分別于一定的時間內(nèi)，測定這兩種溫度培養(yǎng)下菌液的OD值。結(jié)果表明該基因可在大腸桿菌中異源表達，而且導(dǎo)入該基因的大腸桿菌耐熱性及抗冷性明顯增強。蛋白體外活性檢測，結(jié)果表明At-HSP17.6做為分子伴侶，能夠保護熒光素酶的結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而不變性。
- 詳細介紹：
- 詳見附件論文
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 立項目的：1、克隆擬南芥AT-HSP17.6基因，分析保守區(qū)域，構(gòu)建分子進化樹探討基因家族起源關(guān)系。2、構(gòu)建原核表達體系，研究基因的功能。 基本思路：1、基因的鑒定與進化樹構(gòu)建:基因序列翻譯成氨基酸序列，進行同源性檢索，分析保守區(qū)域，構(gòu)建進化樹。2、大腸桿菌中表達：構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達，做SDS-PAGE。在4℃和45℃下進行培養(yǎng)，測定菌液OD值并作圖，探討基因的功能。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 科學(xué)性：1、本實驗以擬南芥、大腸桿菌為材料，培養(yǎng)周期短，易于對實驗重復(fù)驗證。2、實驗涉及到PCR擴增、質(zhì)粒提取、載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化。實驗方法適于本科生操作。 先進性：1、熱激蛋白是當(dāng)今分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)和植物抗逆生理學(xué)的研究熱點。2、利用熱激蛋白改良植物品種，利于環(huán)境的良性循環(huán)。 獨特之處：小熱激蛋白基因易于通過基因工程來改良作物品種，同時在不利環(huán)境下它能迅速產(chǎn)生相應(yīng)的熱激蛋白。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 1、植物熱激反應(yīng)是植物抵抗不良環(huán)境的一種防御機制，如果能用基因工程方法提高熱激蛋白基因的表達量，增強植物耐熱和耐冷性，并研究其對后環(huán)境的影響，這無疑會帶來巨大的經(jīng)濟價值。 2、近年來，生態(tài)環(huán)境的平衡日益遭到破壞，干旱、凍雨等不正常氣候的挑戰(zhàn)也愈加嚴峻，溫室效應(yīng)的加劇直接威脅著21世紀農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，發(fā)展抗逆性農(nóng)作物對全球糧食問題具有非凡的意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本實驗通過提取擬南芥中百合花藥小熱激蛋白LimHSP16.45同源基因AT-HSP17.6。將其導(dǎo)入大腸桿菌中，使其異源表達。之后在45℃高溫和4℃低溫脅迫下，分別于2d，4d，6d，8d，10d時，測定這兩種溫度培養(yǎng)下菌液的OD值。結(jié)果表明：1、系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明AT-HSP17.6更接近于胞質(zhì)Ⅱ型小熱激蛋白基因，而且在進化上表現(xiàn)較近的遺傳距離，說明植物小熱激蛋白家族不同成員可能有不同的起源。2、該基因可在大腸桿菌中異源表達，而且導(dǎo)入該基因的大腸桿菌耐熱性及耐冷性明顯增強。 提純異源表達蛋白，結(jié)果表明：At-HSP17.6做為分子伴侶，能夠保護熒光素酶的結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而不變性。所以當(dāng)加入不同濃度的At-HSP17.6后，關(guān)吸收值后適當(dāng)降低。綜上所述，本研究對小熱激蛋白家族的功能研究和了解植物抗逆的分子機制具有一定的參考價值，在改善農(nóng)作物抗逆研究中也具有一定的理論指導(dǎo)意義。
獲獎情況
- 蘭州大學(xué)第五屆學(xué)術(shù)科技作品競賽一等獎 蘭州大學(xué)2010年"創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)行動計劃"一等獎
鑒定結(jié)果
- 本研究對小熱激蛋白家族的功能研究和了解植物抗逆的分子機制具有一定的參考價值，在改善農(nóng)作物抗逆研究中也具有一定的理論指導(dǎo)意義。
參考文獻
- 1)Kelley PM and Schlesinger MJ. The effect of amino-acid analogues and heat shock on gene expression in chicken embryo fibroblasts. Cell, 1978,15(4):1277-1286. 2)Lee Y, Nagao RT, Lin CY, Key JL. Induction and Regulation of Heat-Shock Gene Expression by an Amino Acid Analog in Soybean Seedlings. Plant Physiol. 1996, 110(1):241-248 3)Nover L, Scharf KD, Neumann D. Formation of cytoplasmic heat shock granules in tomato cell cultures and leaves. Molecular and Cellular Biology, 1983, 3(9):1648-1655 4)Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants. Plant Mol Biol, 1991, 42:579-620 5)鄭國锠, 聶秀菀, 楊慶蘭. 小孢子發(fā)生過程中花粉母細胞間染色質(zhì)穿壁轉(zhuǎn)移現(xiàn)象與機械損和固定液作用的關(guān)系.植物學(xué)報. 1964, 12:289-303 6)朱玉賢,李毅. 現(xiàn)代分子生物學(xué)(第二版) [M].北京,高等教育出版社, 2002,7:281-283 等16篇文獻
同類課題研究水平概述
- 熱激蛋白是生物體對逆境脅迫短期適應(yīng)的必要組成成分，對減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用，因此也被稱為應(yīng)激蛋白。它也成為當(dāng)今分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)和植物抗逆生理學(xué)的一個重要研究內(nèi)容。國內(nèi)的研究方向主要是在它參與生物體內(nèi)新生肽的運輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復(fù)性和降解。 植物的HSP研究始于20世紀80年代初。用較高但并非致死的溫度進行處理，植物就會對通常是致死的溫度產(chǎn)生耐熱性(Yarwood，1961)，一些生長在溫帶的植物如大豆、玉米、甜椒和豌豆等，當(dāng)組織溫度超過32-33℃時就開始合成HSP，而且HSP的合成隨溫度的升高而增加(Lee等，1995；Nieto-Sotelo等，2002；Liu和Shono，1999；DeRocher和Vierling，1994)。然而，高溫并不是唯一誘導(dǎo)HSP表達的刺激因子，乙醇、砷、重金屬、氨基酸類似物，以及其它的一些理化因子會對不同生物體內(nèi)HSP基因的表達產(chǎn)生部分或全部的影響(Key等，1981；Barnett等，1980；Cooper等，1983，1987)。 秦佳等(2007年)采用基因工程方法將CaMV35S啟動子驅(qū)動的定位于番茄葉綠體基質(zhì)中的hsp100/clpB 導(dǎo)入番茄, 使之組成型表達, 發(fā)現(xiàn)在4 ℃低溫下處理21 d后, 轉(zhuǎn)基因番茄比未轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出較輕的冷脅迫癥狀。Fv/Fm 能夠反映PSII 的光能轉(zhuǎn)化效率, 而低溫脅迫會損傷PSII 從而導(dǎo)致Fv/Fm的下降。在4 ℃低溫脅迫下, 非轉(zhuǎn)基因番茄植株的Fv/Fm 值下降21.2%, 而轉(zhuǎn)基因番茄的Fv/Fm 值只下降9.1%; 脅迫解除后, 轉(zhuǎn)基因番茄的Fv/Fm 值恢復(fù)緩慢, 而非轉(zhuǎn)基因植株則迅速死亡。 王佳穎等研究番茄線粒體小分子熱激蛋白LeHsp23.8發(fā)現(xiàn)LeHsp23.8不但可以熱激誘導(dǎo)產(chǎn)生，而且也被低溫誘導(dǎo)表達；在35sCaMV啟動子的調(diào)控下將LeHsp23.8基因轉(zhuǎn)入番茄組成型表達，Northem blotting和Westernblotting分析表明轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)較高的耐低溫性，說明組成型表達線粒體小分子熱激蛋白基因能提高番茄的抗冷性(王佳穎等，2008)。
