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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 擬南芥中百合花藥小熱激蛋白LimHSP16.45同源基因的克隆及其耐熱性和抗冷性研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 通過提取擬南芥中百合花藥小熱激蛋白LimHSP16.45同源基因AT-HSP17.6。將其導(dǎo)入大腸桿菌中，使其異源表達(dá)。之后在45℃高溫和4℃低溫脅迫下，分別于一定的時(shí)間內(nèi)，測(cè)定這兩種溫度培養(yǎng)下菌液的OD值。結(jié)果表明該基因可在大腸桿菌中異源表達(dá)，而且導(dǎo)入該基因的大腸桿菌耐熱性及抗冷性明顯增強(qiáng)。蛋白體外活性檢測(cè)，結(jié)果表明At-HSP17.6做為分子伴侶，能夠保護(hù)熒光素酶的結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而不變性。
- 詳細(xì)介紹：
- 詳見附件論文
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 立項(xiàng)目的：1、克隆擬南芥AT-HSP17.6基因，分析保守區(qū)域，構(gòu)建分子進(jìn)化樹探討基因家族起源關(guān)系。2、構(gòu)建原核表達(dá)體系，研究基因的功能。 基本思路：1、基因的鑒定與進(jìn)化樹構(gòu)建:基因序列翻譯成氨基酸序列，進(jìn)行同源性檢索，分析保守區(qū)域，構(gòu)建進(jìn)化樹。2、大腸桿菌中表達(dá)：構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，做SDS-PAGE。在4℃和45℃下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定菌液OD值并作圖，探討基因的功能。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 科學(xué)性：1、本實(shí)驗(yàn)以擬南芥、大腸桿菌為材料，培養(yǎng)周期短，易于對(duì)實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證。2、實(shí)驗(yàn)涉及到PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)方法適于本科生操作。 先進(jìn)性：1、熱激蛋白是當(dāng)今分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)和植物抗逆生理學(xué)的研究熱點(diǎn)。2、利用熱激蛋白改良植物品種，利于環(huán)境的良性循環(huán)。 獨(dú)特之處：小熱激蛋白基因易于通過基因工程來改良作物品種，同時(shí)在不利環(huán)境下它能迅速產(chǎn)生相應(yīng)的熱激蛋白。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 1、植物熱激反應(yīng)是植物抵抗不良環(huán)境的一種防御機(jī)制，如果能用基因工程方法提高熱激蛋白基因的表達(dá)量，增強(qiáng)植物耐熱和耐冷性，并研究其對(duì)后環(huán)境的影響，這無疑會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 2、近年來，生態(tài)環(huán)境的平衡日益遭到破壞，干旱、凍雨等不正常氣候的挑戰(zhàn)也愈加嚴(yán)峻，溫室效應(yīng)的加劇直接威脅著21世紀(jì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，發(fā)展抗逆性農(nóng)作物對(duì)全球糧食問題具有非凡的意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本實(shí)驗(yàn)通過提取擬南芥中百合花藥小熱激蛋白LimHSP16.45同源基因AT-HSP17.6。將其導(dǎo)入大腸桿菌中，使其異源表達(dá)。之后在45℃高溫和4℃低溫脅迫下，分別于2d，4d，6d，8d，10d時(shí)，測(cè)定這兩種溫度培養(yǎng)下菌液的OD值。結(jié)果表明：1、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明AT-HSP17.6更接近于胞質(zhì)Ⅱ型小熱激蛋白基因，而且在進(jìn)化上表現(xiàn)較近的遺傳距離，說明植物小熱激蛋白家族不同成員可能有不同的起源。2、該基因可在大腸桿菌中異源表達(dá)，而且導(dǎo)入該基因的大腸桿菌耐熱性及耐冷性明顯增強(qiáng)。 提純異源表達(dá)蛋白，結(jié)果表明：At-HSP17.6做為分子伴侶，能夠保護(hù)熒光素酶的結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而不變性。所以當(dāng)加入不同濃度的At-HSP17.6后，關(guān)吸收值后適當(dāng)降低。綜上所述，本研究對(duì)小熱激蛋白家族的功能研究和了解植物抗逆的分子機(jī)制具有一定的參考價(jià)值，在改善農(nóng)作物抗逆研究中也具有一定的理論指導(dǎo)意義。
獲獎(jiǎng)情況
- 蘭州大學(xué)第五屆學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽一等獎(jiǎng) 蘭州大學(xué)2010年"創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃"一等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 本研究對(duì)小熱激蛋白家族的功能研究和了解植物抗逆的分子機(jī)制具有一定的參考價(jià)值，在改善農(nóng)作物抗逆研究中也具有一定的理論指導(dǎo)意義。
參考文獻(xiàn)
- 1)Kelley PM and Schlesinger MJ. The effect of amino-acid analogues and heat shock on gene expression in chicken embryo fibroblasts. Cell, 1978,15(4):1277-1286. 2)Lee Y, Nagao RT, Lin CY, Key JL. Induction and Regulation of Heat-Shock Gene Expression by an Amino Acid Analog in Soybean Seedlings. Plant Physiol. 1996, 110(1):241-248 3)Nover L, Scharf KD, Neumann D. Formation of cytoplasmic heat shock granules in tomato cell cultures and leaves. Molecular and Cellular Biology, 1983, 3(9):1648-1655 4)Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants. Plant Mol Biol, 1991, 42:579-620 5)鄭國(guó)锠, 聶秀菀, 楊慶蘭. 小孢子發(fā)生過程中花粉母細(xì)胞間染色質(zhì)穿壁轉(zhuǎn)移現(xiàn)象與機(jī)械損和固定液作用的關(guān)系.植物學(xué)報(bào). 1964, 12:289-303 6)朱玉賢,李毅. 現(xiàn)代分子生物學(xué)(第二版) [M].北京,高等教育出版社, 2002,7:281-283 等16篇文獻(xiàn)
同類課題研究水平概述
- 熱激蛋白是生物體對(duì)逆境脅迫短期適應(yīng)的必要組成成分，對(duì)減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用，因此也被稱為應(yīng)激蛋白。它也成為當(dāng)今分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)和植物抗逆生理學(xué)的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容。國(guó)內(nèi)的研究方向主要是在它參與生物體內(nèi)新生肽的運(yùn)輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復(fù)性和降解。 植物的HSP研究始于20世紀(jì)80年代初。用較高但并非致死的溫度進(jìn)行處理，植物就會(huì)對(duì)通常是致死的溫度產(chǎn)生耐熱性(Yarwood，1961)，一些生長(zhǎng)在溫帶的植物如大豆、玉米、甜椒和豌豆等，當(dāng)組織溫度超過32-33℃時(shí)就開始合成HSP，而且HSP的合成隨溫度的升高而增加(Lee等，1995；Nieto-Sotelo等，2002；Liu和Shono，1999；DeRocher和Vierling，1994)。然而，高溫并不是唯一誘導(dǎo)HSP表達(dá)的刺激因子，乙醇、砷、重金屬、氨基酸類似物，以及其它的一些理化因子會(huì)對(duì)不同生物體內(nèi)HSP基因的表達(dá)產(chǎn)生部分或全部的影響(Key等，1981；Barnett等，1980；Cooper等，1983，1987)。 秦佳等(2007年)采用基因工程方法將CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的定位于番茄葉綠體基質(zhì)中的hsp100/clpB 導(dǎo)入番茄, 使之組成型表達(dá), 發(fā)現(xiàn)在4 ℃低溫下處理21 d后, 轉(zhuǎn)基因番茄比未轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出較輕的冷脅迫癥狀。Fv/Fm 能夠反映PSII 的光能轉(zhuǎn)化效率, 而低溫脅迫會(huì)損傷PSII 從而導(dǎo)致Fv/Fm的下降。在4 ℃低溫脅迫下, 非轉(zhuǎn)基因番茄植株的Fv/Fm 值下降21.2%, 而轉(zhuǎn)基因番茄的Fv/Fm 值只下降9.1%; 脅迫解除后, 轉(zhuǎn)基因番茄的Fv/Fm 值恢復(fù)緩慢, 而非轉(zhuǎn)基因植株則迅速死亡。 王佳穎等研究番茄線粒體小分子熱激蛋白LeHsp23.8發(fā)現(xiàn)LeHsp23.8不但可以熱激誘導(dǎo)產(chǎn)生，而且也被低溫誘導(dǎo)表達(dá)；在35sCaMV啟動(dòng)子的調(diào)控下將LeHsp23.8基因轉(zhuǎn)入番茄組成型表達(dá)，Northem blotting和Westernblotting分析表明轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)較高的耐低溫性，說明組成型表達(dá)線粒體小分子熱激蛋白基因能提高番茄的抗冷性(王佳穎等，2008)。
