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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 雞β-防御素AvBD-5真核載體構(gòu)建及免疫活性的研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類(lèi)：
- 生命科學(xué)
- 大類(lèi)：
- 自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文
- 簡(jiǎn)介：
- 本文設(shè)計(jì)構(gòu)建帶有雞β-防御素AvBD-5基因的SEp9 DNA疫苗，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，使小鼠獲得對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗性，為研究SEp9 DNA疫苗和AvBD-5作為內(nèi)源免疫物質(zhì)的免疫作用免疫活性在家禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用，將其作為一種高效無(wú)毒、無(wú)殘留的免疫促進(jìn)劑替代抗生素，提高家禽抗病力以及禽產(chǎn)品的安全性，對(duì)禽類(lèi)的生產(chǎn)以及禽產(chǎn)品的安全具有重要的意義。
- 詳細(xì)介紹：
- 前言 本文設(shè)計(jì)構(gòu)建帶有雞β-防御素AvBD-5基因的SEp9 DNA疫苗，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，使小鼠獲得對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗性，為研究SEp9 DNA疫苗和AvBD-5作為內(nèi)源免疫物質(zhì)的免疫作用免疫活性在家禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用，將其作為一種高效無(wú)毒、無(wú)殘留的免疫促進(jìn)劑替代抗生素，提高家禽抗病力以及禽產(chǎn)品的安全性，對(duì)禽類(lèi)的生產(chǎn)以及禽產(chǎn)品的安全具有重要的意義。 材料與方法 采用PCR的方法擴(kuò)增AvBD-5及SEp9基因，分別構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pVAX1-AvBD5、pVAX1-SEp9及pVAX1-SEp9-AvBD5；用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提法獲得高純度無(wú)內(nèi)毒素重組真核表達(dá)質(zhì)粒，作為DNA疫苗免疫動(dòng)物后，用ELISA檢測(cè)小鼠血清中特異性IgG抗體水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腸組織中MCP-1基因表達(dá)量差異，分離小鼠淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)分析T淋巴細(xì)胞亞群含量變化，在首免后第42天用腸炎沙門(mén)氏菌對(duì)小鼠攻毒，檢測(cè)免疫保護(hù)效率。 設(shè)計(jì)AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗，單獨(dú)或聯(lián)合的體液免疫、粘膜免疫方式導(dǎo)入到動(dòng)物體內(nèi)，使其獲得對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗性，初步測(cè)定AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗的免疫效應(yīng)并研究DNA疫苗的保護(hù)效應(yīng)和雞β-防御素AvBD-5的免疫活性， 結(jié)果 研究結(jié)果表明pVAX1-SEp9、pVAX1-SEp9-AvBD5均能在小鼠體內(nèi)刺激免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗SEp9的特異性抗體，pVAX1-SEp9-AvBD5組的IgG抗體OD450nm與對(duì)照組相比最高，達(dá)到0.33，同時(shí)能誘導(dǎo)腸組織產(chǎn)生MCP-1，引起T淋巴細(xì)胞亞群增殖，與對(duì)照相比，最高分別為63.17%、43.11%、20.57%。攻毒后pVAX1-SEp9組和pVAX1-SEp9-AvBD5組中小鼠新鮮糞便中SE菌落數(shù)與對(duì)照組相比明顯下降，pVAX1-SEp9-AvBD5組在攻毒后的第4天，糞便中僅含SE 22.90CFU/g。 結(jié)論 實(shí)驗(yàn)首次將AvBD5同時(shí)作為抗菌多肽和內(nèi)源免疫物質(zhì)研究其對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的免疫增強(qiáng)作用，探尋AvBD5作為一種新型免疫佐劑使用的可能性。研究結(jié)果證明了雞β-防御素AvBD-5能有效刺激雞的免疫防御系統(tǒng)，增加機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的能力，提高了小鼠對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌感染的保護(hù)效率，為AvBD-5作為一種新型免疫佐劑，應(yīng)用于DNA疫苗的研究與開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
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作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 禽類(lèi)是眾多病原體的攜帶者，病原體造成禽類(lèi)產(chǎn)品污染，同時(shí)也威脅人類(lèi)健康。在抗生素替代劑中，抗菌肽具有廣譜抗菌活性、抗病毒和免疫增強(qiáng)等作用，對(duì)機(jī)體無(wú)毒害、無(wú)殘留等，備受關(guān)注。 本實(shí)驗(yàn)在已有研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)AvBD-5 DNA和SEp9 DNA疫苗，單獨(dú)或聯(lián)合的體液、粘膜免疫方式導(dǎo)入到動(dòng)物體內(nèi)，測(cè)定AvBD-5 DNA和SEp9 DNA疫苗的免疫效應(yīng)。以此研究預(yù)防禽腸炎沙門(mén)氏菌感染的DNA疫苗。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1.首次從粵黃雞舌頭組織中克隆雞β-防御素AvBD5成熟肽基因 2.將IRES插入真核表達(dá)載體pVAX1的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體pVAX1-IRES，并將SEp9基因和AvBD5成熟肽基因插入雙順?lè)醋虞d體中，構(gòu)建了共表達(dá)載體該載體可同時(shí)獨(dú)立的表達(dá)SEp9基因和AvBD5成熟肽基因 3.首次將AvBD5同時(shí)作為抗菌多肽和內(nèi)源免疫物質(zhì)，探尋AvBD5作為新型免疫佐劑使用的可能性
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本研究旨在發(fā)展完善一種新型高效的預(yù)防家禽腸炎沙門(mén)氏菌感染的DNA藥物，研究禽β-防御素AvBD-5的免疫活性，并探討能使其作為一種新型免疫佐劑的可能性。本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建帶有雞β-防御素AvBD-5基因的DNA疫苗，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入模式動(dòng)物小鼠體內(nèi)，使其獲得對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗性，并研究DNA疫苗的保護(hù)效應(yīng)和雞β-防御素AvBD-5的免疫活性。為AvBD-5作為佐劑，應(yīng)用于DNA疫苗的研究開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- AvBD是禽類(lèi)先天內(nèi)源免疫防御系統(tǒng)重要組成部分。本文構(gòu)建了3個(gè)重組真核表達(dá)載體： pVAX1-AvBD5、pVAX1-SEp9和共表達(dá)載體pVAX1-SEp9-AvBD5。將3個(gè)重組質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫小鼠。檢測(cè)小鼠血清中特異性IgG抗體水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腸組織中MCP-1基因表達(dá)量差異；分離小鼠淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)分析T淋巴細(xì)胞亞群含量變化。檢測(cè)免疫保護(hù)效率，結(jié)果表明pVAX1-SEp9、pVAX1-SEp9-AvBD5均能在小鼠體內(nèi)刺激免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗SEp9的特異性抗體小鼠新鮮糞便中SE菌落數(shù)與對(duì)照組相比明顯下降。本研究證明了雞AvBD-5能有效刺激雞免疫防御系統(tǒng)，增加機(jī)體特異性免疫應(yīng)答能力，提高小鼠對(duì)SE感染的保護(hù)效率。 研究結(jié)果證明了雞β-防御素AvBD-5能有效刺激雞的免疫防御系統(tǒng)，增加機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的能力，提高了小鼠對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌感染的保護(hù)效率，為AvBD-5作為一種新型免疫佐劑，應(yīng)用于DNA疫苗的研究與開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 2010年華南農(nóng)業(yè)大學(xué)“丁穎杯”課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽二等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 經(jīng)廣東省團(tuán)委鑒定屬實(shí)
參考文獻(xiàn)
- 1、pVAX1-SEp9-AvBD5試驗(yàn)組流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示意圖 2、Meade K G, Higgs R, Lloyd A T, et al. Differential antimicrobial peptide gene expression patterns during early chicken embryological development. Developmental and Comparative Immunology, 2009, (33): 516-524 3、Van Dijk A, Veldhuizen E J, Kalkhove S I, et al. The β-defensin gallinacin-6 is expressed in the chicken digestive tract and has antimicrobial activity against food-borne pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2007, 51(3): 912-922 4、Van Dijk A, Veldhuizen E J, Haagsman H P. Avian defensins. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2008, 124 (1-2): 1-18 5、韓宗璽, 馬得瑩, 劉勝旺等. 重組雞抗菌肽Gallinacin-9的原核表達(dá)及其抗菌活性的鑒定. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008, 39(10): 1426-1431 6、廖文艷, 馬得瑩, 韓宗璽等. 重組雞β-防御素10蛋白的原核表達(dá)及其抗菌活性的測(cè)定. 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)報(bào). 2008, 10(30): 765-769
同類(lèi)課題研究水平概述
- 腸炎沙門(mén)氏菌不僅能引起家禽發(fā)病死亡造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且感染家禽的產(chǎn)品作為腸炎沙門(mén)氏菌的攜帶者，還嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。日、美等發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)生的食物中毒事件中40%-80%是由禽沙門(mén)氏菌引起的，其中主要病原為腸炎沙門(mén)氏菌，每年在美國(guó)由于食物傳播沙門(mén)氏菌感染致死的超過(guò)600人，140萬(wàn)人染病，每年都要花費(fèi)4.64億到23億美金用于治療食物傳播沙門(mén)氏菌感染。由腸炎沙門(mén)氏菌引起人的急性胃腸炎，在世界各國(guó)有增加的趨勢(shì)，已成為國(guó)際公共衛(wèi)生的一個(gè)重要課題。 飼用抗生素被廣泛地用于降低禽類(lèi)發(fā)病率和維持健康。然而，長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)導(dǎo)致抗生素在禽產(chǎn)品中殘留及細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，并通過(guò)食物鏈威脅人類(lèi)健康。因此，需要一種既有效又環(huán)保的新方法來(lái)控制禽類(lèi)疾病。在眾多的抗生素替代劑中，抗菌肽由于其分布廣泛、具有廣譜抗菌活性、抗病毒和免疫增強(qiáng)等作用，并且對(duì)機(jī)體無(wú)毒害、無(wú)殘留等，越來(lái)越受到關(guān)注。 防御素是一類(lèi)重要的內(nèi)源性抗菌肽，具有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要的作用。雞的染色體共編碼14種β防御素，被稱為AvBD1-14。雞β防御素作為雞的重要天然免疫屏障，廣泛分布于雞體內(nèi)各種組織器官中，在雞的先天性免疫和獲得性免疫中都具有重要的作用。 利用商品化SE菌苗作為疫苗是用來(lái)控制SE污染的一種方法。然而，SE菌苗存在的內(nèi)毒素可能會(huì)對(duì)雞產(chǎn)生潛在的危害。因此， SE亞單位疫苗的研制已經(jīng)被提出。已經(jīng)報(bào)道了SE鞭毛抗原可以作為疫苗的巨大潛力。SE鞭毛抗原最主要的成分是FliC抗原，而FliC抗原最主要的抗原位點(diǎn)是SEp9。Yukiko Toyota-Hanatani等人（2009）用SEp9和弗氏完全佐劑聯(lián)合接種雞，然后口服攻毒SE，與對(duì)照相比，SEp9的SE菌數(shù)量顯著降低，證明了SEp9抗原是一個(gè)有效的抗原，能有效的抑制SE在雞腸道的定殖。Yukiko Toyota-Hanatani等人（2008）從組織學(xué)上證明了SEp9可以成為SE亞單位疫苗的候選抗原。注射SEp9后，雞體內(nèi)能產(chǎn)生特異性抗體，且在注射部位周?chē)芤鹧芰馨图?xì)胞的積聚。他們的研究顯示：SEp9作為一個(gè)亞單位疫苗，在雞SE感染后的連續(xù)免疫反應(yīng)和抗原遞呈中都具有重要的作用。
