基本信息
- 項目名稱：
- 三種食源性致病菌的PCR快速檢測
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本研究建立的對沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的單獨PCR檢測和多重RCR快速檢測方法，可以三小時內(nèi)在同一PCR管中同時快速、特異、靈敏的檢測出這三種致病菌，為食品中致病菌的快速檢測提供了新手段和理論依據(jù)。
- 詳細介紹：
- 本項目針對目前國內(nèi)外的食品衛(wèi)生標準，以食品中常見的3種食源性致病菌——大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌為研究對象，分別用各自的特異性引物進行單獨PCR擴增和雙重PCR、三重PCR擴增，驗證引物的特異性，不斷優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，建立對沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的多重RCR 快速檢驗方法。該方法可以在3小時內(nèi)在同一PCR管中同時快速、靈敏及特異檢測大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌，可推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測、水源檢測、商品檢驗檢疫等領(lǐng)域。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的: 建立對三種食源性致病菌--大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌的快速、敏感、特異的單獨PCR和多重PCR診斷檢驗方法，為食源性致病菌的多重PCR快速檢測提供理論依據(jù)和實驗指導(dǎo)。 基本思路: 先提取這三種食源性致病菌的DNA，分別用各自的特異性引物進行PCR擴增，驗證引物的特異性，不斷優(yōu)化PCR反應(yīng)體系,建立對沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的RCR 快速檢驗方法。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 微生物的檢測是食品檢驗中的一項重要內(nèi)容。目前常規(guī)方法操作繁瑣，耗時長，通常需要幾天的培養(yǎng)鑒定時間，不能達到快速監(jiān)測食品的目的。本研究在多次重復(fù)實驗的基礎(chǔ)上，確立了PCR檢測的優(yōu)化體系和條件，建立的對三種食源性致病菌PCR快速檢測，相對于傳統(tǒng)檢測方法，極大地縮短了檢測時間，具有靈敏、簡便、特異性強的優(yōu)點。從而在一定程度上提前消除由于食品中的致病菌所造成的危害，提高食源性疾病的檢測和控制能力。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌是常見污染食品的致病菌，主要通過食品、飲水感染人類，嚴重侵害人類健康。目前，這三種食源性致病菌是我國進出口食品的主要檢測項目，其常規(guī)方法需多個步驟，操作復(fù)雜，檢測周期長。本研究建立能特異、靈敏、快速檢測出食品中大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的PCR檢測方法。這樣既可避免污染，又具有簡便、信息量大的特點，可推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測、水源檢測等領(lǐng)域。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本研究目的是建立對三種食源性致病菌--沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的快速、敏感、特異的單獨PCR和多重PCR診斷檢驗方法，為食源性致病菌的多重PCR快速檢測提供理論依據(jù)和實驗指導(dǎo)。方法是先提取大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌這三種食源性致病菌的DNA，分別用各自的特異性引物進行三種菌的單獨PCR，之后將三種菌兩兩組合進行雙重PCR以及三種菌同時進行三重PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀下觀察電泳結(jié)果。得到的實驗結(jié)果與結(jié)論：三種食源性致病菌單獨PCR擴增都得到目的片斷，大腸桿菌約1000 bp，單增李斯特菌約750 bp,沙門氏菌約300 bp，沒有擴增出其它非特異性片段。雙重PCR和三重PCR檢測結(jié)果與單基因PCR檢測的靈敏度相同，也都獲得了相應(yīng)的片段。用三種菌分別人工感染兩種常見食品——飲料與面包，PCR檢測的結(jié)果均獲得目的菌的特異性片段，并且結(jié)果穩(wěn)定。本研究建立的對沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的單獨PCR檢驗和多重RCR快速檢驗方法，可以同時快速、特異、靈敏的檢測出這三種致病菌，為食品中致病菌的快速檢測提供了新手段和理論依據(jù)。
獲獎情況
- 2011年5月12日云南農(nóng)業(yè)大學(xué)第九屆“挑戰(zhàn)杯”學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽二等獎 2011年5月31日第六屆云南高校青年學(xué)術(shù)科技節(jié)終審決賽三等獎
鑒定結(jié)果
- 2011年5月12日云南農(nóng)業(yè)大學(xué)第九屆“挑戰(zhàn)杯”學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽二等獎 2011年5月31日第六屆云南高校青年學(xué)術(shù)科技節(jié)終審決賽三等獎
參考文獻
- [1]ISBN 92 4554574 1 NLM classification. WHO global strategy for food safety. 2002. [2]李業(yè)鵬，鐘凱.食品中沙門菌PCR檢測方法的建立[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志，2006， 8(1):17-22. [3]魯滿新．現(xiàn)代檢測技術(shù)在食品安全中的應(yīng)用[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(21)： 6 589-6 590 [4]黃韜睿，李玉鋒，王鑫．PCR和ELISA在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，9：182-184 [5]Malorny B,Paccassoni E,Fach P,et al.Diagnostic realtime PCR for detection of Salmonella in food[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,7046-7052. [6]Malorny B,Hoorfar J,Bunge C,et al.Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR:towards an international standard[J].Applied and Enviromental Microbiology,2003,69(1):290-296. [7]林蕾，張煒．食品微生物檢測技術(shù)的研究進展[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，15(10)：97-99
同類課題研究水平概述
- 由食源性病原微生物所引起的食物中毒事件，絕大多數(shù)是由病原性細菌所致，常見的有沙門氏菌、志賀氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌等。其中大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌是最常見污染食品的致病菌，主要通過食品、飲水感染人類,導(dǎo)致細菌性食物中毒，同時這三種食源性致病菌還是食品常規(guī)微生物檢測中的指示菌。 目前，國標中提供的檢測病原菌方法為傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)，包括生化和血清學(xué)鑒定等多個復(fù)雜的過程，一般需4～7天，操作繁瑣，需時長、存在特異性不強、靈敏度不高等問題，而且環(huán)境中還存在一些難以培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物，因此這些方法已不能完全適應(yīng)于衛(wèi)生檢測的需要。自從十九世紀八十年代中期, PCR技術(shù)的引入已證明是一種具有不可估量價值的方法,它能夠快速,敏感,特異地從不同的食品樣品中檢出病原菌,具有廣闊的應(yīng)用前景。 分子生物學(xué)方法是食源性致病菌檢測方法的主要發(fā)展方向。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是近十多年來應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)方法，在食源性致病菌的檢測中，一般是以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列設(shè)計特異性引物進行擴增，進而用凝膠電泳和紫外核酸檢測儀觀察擴增結(jié)果。分子生物學(xué)方法由于操作簡單、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強，并可以對難以培養(yǎng)的微生物進行檢測，因而在致病菌分析檢測中具有很好的發(fā)展前景。目前，以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)，如嵌套式PCR、RT-PCR、DNA指紋圖譜技術(shù)、實時熒光定量PCR和其他擴增技術(shù)，已比較成功地應(yīng)用于食源食源性致病菌的篩選和鑒定。 本項目針對目前國內(nèi)外的食品衛(wèi)生標準，以食品中常見的3種食源性致病菌——大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌為研究對象，分別用各自的特異性引物進行三種菌的單獨PCR，之后將三種菌兩兩組合進行雙重PCR以及三種菌同時進行三重PCR擴增，驗證引物的特異性，不斷優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，建立對沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的RCR 快速檢驗方法。該方法可以3小時內(nèi)在同一PCR管中同時快速、靈敏及特異檢測大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌，可推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測、水源檢測、商品檢驗檢疫等領(lǐng)域。
