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基本信息

項(xiàng)目名稱：
三種食源性致病菌的PCR快速檢測(cè)
小類(lèi)：
生命科學(xué)
簡(jiǎn)介：
本研究建立的對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的單獨(dú)PCR檢測(cè)和多重RCR快速檢測(cè)方法，可以三小時(shí)內(nèi)在同一PCR管中同時(shí)快速、特異、靈敏的檢測(cè)出這三種致病菌，為食品中致病菌的快速檢測(cè)提供了新手段和理論依據(jù)。
詳細(xì)介紹：
本項(xiàng)目針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，以食品中常見(jiàn)的3種食源性致病菌——大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌為研究對(duì)象，分別用各自的特異性引物進(jìn)行單獨(dú)PCR擴(kuò)增和雙重PCR、三重PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性，不斷優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，建立對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的多重RCR 快速檢驗(yàn)方法。該方法可以在3小時(shí)內(nèi)在同一PCR管中同時(shí)快速、靈敏及特異檢測(cè)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌，可推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測(cè)、水源檢測(cè)、商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。

作品專業(yè)信息

撰寫(xiě)目的和基本思路

目的: 建立對(duì)三種食源性致病菌--大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌的快速、敏感、特異的單獨(dú)PCR和多重PCR診斷檢驗(yàn)方法，為食源性致病菌的多重PCR快速檢測(cè)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。 基本思路: 先提取這三種食源性致病菌的DNA，分別用各自的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性，不斷優(yōu)化PCR反應(yīng)體系,建立對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的RCR 快速檢驗(yàn)方法。

科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處

微生物的檢測(cè)是食品檢驗(yàn)中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。目前常規(guī)方法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，通常需要幾天的培養(yǎng)鑒定時(shí)間，不能達(dá)到快速監(jiān)測(cè)食品的目的。本研究在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確立了PCR檢測(cè)的優(yōu)化體系和條件，建立的對(duì)三種食源性致病菌PCR快速檢測(cè)，相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，具有靈敏、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。從而在一定程度上提前消除由于食品中的致病菌所造成的危害，提高食源性疾病的檢測(cè)和控制能力。

應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義

大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門(mén)氏菌是常見(jiàn)污染食品的致病菌，主要通過(guò)食品、飲水感染人類(lèi)，嚴(yán)重侵害人類(lèi)健康。目前，這三種食源性致病菌是我國(guó)進(jìn)出口食品的主要檢測(cè)項(xiàng)目，其常規(guī)方法需多個(gè)步驟，操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)。本研究建立能特異、靈敏、快速檢測(cè)出食品中大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門(mén)氏菌的PCR檢測(cè)方法。這樣既可避免污染，又具有簡(jiǎn)便、信息量大的特點(diǎn)，可推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測(cè)、水源檢測(cè)等領(lǐng)域。

學(xué)術(shù)論文摘要

本研究目的是建立對(duì)三種食源性致病菌--沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的快速、敏感、特異的單獨(dú)PCR和多重PCR診斷檢驗(yàn)方法，為食源性致病菌的多重PCR快速檢測(cè)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。方法是先提取大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌這三種食源性致病菌的DNA，分別用各自的特異性引物進(jìn)行三種菌的單獨(dú)PCR，之后將三種菌兩兩組合進(jìn)行雙重PCR以及三種菌同時(shí)進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀下觀察電泳結(jié)果。得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論：三種食源性致病菌單獨(dú)PCR擴(kuò)增都得到目的片斷，大腸桿菌約1000 bp，單增李斯特菌約750 bp,沙門(mén)氏菌約300 bp，沒(méi)有擴(kuò)增出其它非特異性片段。雙重PCR和三重PCR檢測(cè)結(jié)果與單基因PCR檢測(cè)的靈敏度相同，也都獲得了相應(yīng)的片段。用三種菌分別人工感染兩種常見(jiàn)食品——飲料與面包，PCR檢測(cè)的結(jié)果均獲得目的菌的特異性片段，并且結(jié)果穩(wěn)定。本研究建立的對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的單獨(dú)PCR檢驗(yàn)和多重RCR快速檢驗(yàn)方法，可以同時(shí)快速、特異、靈敏的檢測(cè)出這三種致病菌，為食品中致病菌的快速檢測(cè)提供了新手段和理論依據(jù)。

獲獎(jiǎng)情況

2011年5月12日云南農(nóng)業(yè)大學(xué)第九屆“挑戰(zhàn)杯”學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽二等獎(jiǎng) 2011年5月31日第六屆云南高校青年學(xué)術(shù)科技節(jié)終審決賽三等獎(jiǎng)

鑒定結(jié)果

2011年5月12日云南農(nóng)業(yè)大學(xué)第九屆“挑戰(zhàn)杯”學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽二等獎(jiǎng) 2011年5月31日第六屆云南高校青年學(xué)術(shù)科技節(jié)終審決賽三等獎(jiǎng)

參考文獻(xiàn)

[1]ISBN 92 4554574 1 NLM classification. WHO global strategy for food safety. 2002. [2]李業(yè)鵬，鐘凱.食品中沙門(mén)菌PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2006， 8(1):17-22. [3]魯滿新．現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)在食品安全中的應(yīng)用[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(21)： 6 589-6 590 [4]黃韜睿，李玉鋒，王鑫．PCR和ELISA在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，9：182-184 [5]Malorny B,Paccassoni E,Fach P,et al.Diagnostic realtime PCR for detection of Salmonella in food[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,7046-7052. [6]Malorny B,Hoorfar J,Bunge C,et al.Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR:towards an international standard[J].Applied and Enviromental Microbiology,2003,69(1):290-296. [7]林蕾，張煒．食品微生物檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，15(10)：97-99

同類(lèi)課題研究水平概述

由食源性病原微生物所引起的食物中毒事件，絕大多數(shù)是由病原性細(xì)菌所致，常見(jiàn)的有沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌等。其中大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌是最常見(jiàn)污染食品的致病菌，主要通過(guò)食品、飲水感染人類(lèi),導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒，同時(shí)這三種食源性致病菌還是食品常規(guī)微生物檢測(cè)中的指示菌。 目前，國(guó)標(biāo)中提供的檢測(cè)病原菌方法為傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)，包括生化和血清學(xué)鑒定等多個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，一般需4～7天，操作繁瑣，需時(shí)長(zhǎng)、存在特異性不強(qiáng)、靈敏度不高等問(wèn)題，而且環(huán)境中還存在一些難以培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物，因此這些方法已不能完全適應(yīng)于衛(wèi)生檢測(cè)的需要。自從十九世紀(jì)八十年代中期, PCR技術(shù)的引入已證明是一種具有不可估量?jī)r(jià)值的方法,它能夠快速,敏感,特異地從不同的食品樣品中檢出病原菌,具有廣闊的應(yīng)用前景。 分子生物學(xué)方法是食源性致病菌檢測(cè)方法的主要發(fā)展方向。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是近十多年來(lái)應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)方法，在食源性致病菌的檢測(cè)中，一般是以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而用凝膠電泳和紫外核酸檢測(cè)儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。分子生物學(xué)方法由于操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)，并可以對(duì)難以培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測(cè)，因而在致病菌分析檢測(cè)中具有很好的發(fā)展前景。目前，以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)，如嵌套式PCR、RT-PCR、DNA指紋圖譜技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和其他擴(kuò)增技術(shù)，已比較成功地應(yīng)用于食源食源性致病菌的篩選和鑒定。 本項(xiàng)目針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，以食品中常見(jiàn)的3種食源性致病菌——大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌為研究對(duì)象，分別用各自的特異性引物進(jìn)行三種菌的單獨(dú)PCR，之后將三種菌兩兩組合進(jìn)行雙重PCR以及三種菌同時(shí)進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性，不斷優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，建立對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌的RCR 快速檢驗(yàn)方法。該方法可以3小時(shí)內(nèi)在同一PCR管中同時(shí)快速、靈敏及特異檢測(cè)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌，可推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測(cè)、水源檢測(cè)、商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。
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