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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 中國(guó)蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫(kù)的構(gòu)建?
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 我們前期采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從中國(guó)蛇島蝮蛇蛇毒中鑒定出20余種蛋白[5]，獲得了檢出蛋白的部分氨基酸序列，為目的蛋白基因克隆提供了信息。為探索和開發(fā)具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蛇類藥用基因，進(jìn)一步對(duì)中國(guó)蛇島蝮蛇蛋白活性組分表達(dá)和功能進(jìn)行研究，加強(qiáng)對(duì)中國(guó)蛇島蝮蛇的保護(hù)，我們構(gòu)建了中國(guó)蛇島蝮蛇毒腺的cDNA文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了分析。
- 詳細(xì)介紹：
- 為研究中國(guó)蛇島蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensist)基因工程產(chǎn)品，采用SMART(switching mechanism at 5’ end of RNA transcript) 技術(shù)構(gòu)建其毒腺的cDNA表達(dá)文庫(kù)。采用RNAiso 試劑提取毒腺總RNA，再采用Poly (A) PuristTM 試劑盒分離純化mRNA，第一鏈cDNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成，雙鏈cDNA經(jīng)LD-PCR合成并擴(kuò)增；分級(jí)分離去除小片段，收集大于400 bp的cDNA片段，與質(zhì)粒栽體pDNR-LIB連接，采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B。構(gòu)建的蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫(kù)庫(kù)容量為8×107 cfu/ml，大多數(shù)插入片段大于1 000 bp，重組質(zhì)粒表達(dá)率高(100%)。本研究成功構(gòu)建了高質(zhì)量的蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫(kù)，表達(dá)文庫(kù)質(zhì)量高，可用于進(jìn)一步克隆和表達(dá)GSS蛋白活性組分基因，并對(duì)其功能進(jìn)行研究。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：構(gòu)建完整的cDNA文庫(kù)，為基因工程制取中國(guó)蛇島蝮蛇蛇毒奠定基礎(chǔ) 基本思路：提取毒腺總RNA，并分離純化mRNA，第一鏈cDNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成，雙鏈cDNA經(jīng)LD-PCR合成并擴(kuò)增；分級(jí)分離去除小片段，收集大于400 bp的cDNA片段，與質(zhì)粒栽體pDNR-LIB連接，采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 傳統(tǒng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法難以獲得低豐度表達(dá)基因，需消耗大量mRNA、難合成完整、文庫(kù)構(gòu)建繁瑣耗時(shí)。中國(guó)蛇島蝮蛇為國(guó)家級(jí)保護(hù)特有蛇種，通過(guò)增加毒腺數(shù)量獲得大量mRNA是行不通的。本研究采用SMART方法，解決了以上問(wèn)題，一條中國(guó)蛇島蝮蛇的毒腺就可滿足cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。且SMART方法能保證cDNA序列信息完整性，獲得全長(zhǎng)基因機(jī)率高所構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)不需體外包裝，易擴(kuò)增保存、篩選和利于目的基因表達(dá)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 我們前期采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從中國(guó)蛇島蝮蛇蛇毒中鑒定出20余種蛋白[5]，獲得了檢出蛋白的部分氨基酸序列，為目的蛋白基因克隆提供了信息。為探索和開發(fā)具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蛇類藥用基因，進(jìn)一步對(duì)中國(guó)蛇島蝮蛇蛋白活性組分表達(dá)和功能進(jìn)行研究，加強(qiáng)對(duì)中國(guó)蛇島蝮蛇的保護(hù)，我們構(gòu)建了中國(guó)蛇島蝮蛇毒腺的cDNA文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了分析。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 為研究中國(guó)蛇島蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensist)基因工程產(chǎn)品，采用SMART(switching mechanism at 5’ end of RNA transcript) 技術(shù)構(gòu)建其毒腺的cDNA表達(dá)文庫(kù)。采用RNAiso 試劑提取毒腺總RNA，再采用Poly (A) PuristTM 試劑盒分離純化mRNA，第一鏈cDNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成，雙鏈cDNA經(jīng)LD-PCR合成并擴(kuò)增；分級(jí)分離去除小片段，收集大于400 bp的cDNA片段，與質(zhì)粒栽體pDNR-LIB連接，采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B。構(gòu)建的蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫(kù)庫(kù)容量為8×107 cfu/ml，大多數(shù)插入片段大于1 000 bp，重組質(zhì)粒表達(dá)率高(100%)。本研究成功構(gòu)建了高質(zhì)量的蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫(kù)，表達(dá)文庫(kù)質(zhì)量高，可用于進(jìn)一步克隆和表達(dá)GSS蛋白活性組分基因，并對(duì)其功能進(jìn)行研究。
獲獎(jiǎng)情況
- 獲2011年大連醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新一等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 構(gòu)建的文庫(kù)庫(kù)容量為8×107，完全滿足使用要求，l6個(gè)隨機(jī)挑選單菌落的PCR結(jié)果均顯示含有重組質(zhì)粒。提取擴(kuò)增后文庫(kù)質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)彌散條帶明顯片段分子量大于一千bp，表明構(gòu)建文庫(kù)完整。
參考文獻(xiàn)
- [1] Liu S, Sun M, Sun C, et al. A novel serine protease from the snake venom of Agkistrodon blomhoffii ussurensis. Toxicon, 2008, 52(7): 760–768. [2] Liu S, Sun M, Greenaway F T. A novel plasminogen activator from Agkistrodon blomhoffii Ussurensis venom (ABUSV-PA): Purification and characterization. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 348(4): 1279–1287. [3] 薩姆布魯克 J, 拉塞爾D W: 黃培堂等譯. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 ( 3版). 北京: 科學(xué)出版社，2002, 857–916． [4] 鐘肖芬，衛(wèi)劍文，趙貴軍，等. 平頦海蛇毒腺cDNA表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，40(3): 66–69
同類課題研究水平概述
- cDNA文庫(kù)的建立為深入研究中國(guó)蛇島蝮蛇蛇毒有效成分提供了重要的基因資源，在基因序列與蛋白之間架起一座橋梁。不僅可以用于檢測(cè)許多已知基因，同時(shí)也可獲得新基因，并且使進(jìn)一步采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)蛇毒制劑成為可能。 傳統(tǒng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法難以獲得低豐度表達(dá)基因，需消耗較大量mRNA、難合成完整的cDNA、文庫(kù)構(gòu)建步驟繁瑣耗時(shí)。中國(guó)蛇島蝮蛇為國(guó)家級(jí)保護(hù)特有蛇種，通過(guò)增加毒腺數(shù)量獲得大量mRNA是行不通的。 近年來(lái) ，D NA文庫(kù)構(gòu)建的新方法 、新技術(shù)雖多種多樣、層出不窮但其共同目的是使得D NA文庫(kù)構(gòu)建更加迅速、簡(jiǎn)便 、高效、高質(zhì)量、滿足研究的需要。 其中包括以下幾種重要方法： 一、固相 c DNA文庫(kù)構(gòu)建 二．Ol i g o—c a p p i n g方 法構(gòu) 建 c DNA文庫(kù) 三、錄病毒c DN A表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建
