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基本信息
- 項目名稱：
- 人絲氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor的基因克隆與序列分析
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- Hespintor是應(yīng)用抑制性差減扣除雜交技術(shù)從肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2中篩選得到一未知功能新基因，經(jīng)RT-PCR驗證后，結(jié)合生物信息學(xué)確定該基因?qū)儆谝环N新的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子。同源分析表明，Hespintor具有與食管癌相關(guān)基因2（ECRG2）高度同源的serpin基本結(jié)構(gòu)。由于ECRG2具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等作用，因此提示Hespintor可能具有同樣的能力。
- 詳細(xì)介紹：
- 絲氨酸蛋白酶抑制因子是一類絲氨酸蛋白酶活性調(diào)節(jié)因子，參與血凝、纖維蛋白溶解、炎癥和免疫反應(yīng)、胚胎發(fā)生及個體發(fā)育過程。根據(jù)它們的序列、二硫鍵數(shù)目和三維結(jié)構(gòu)，至少可以歸類為18個非同源蛋白質(zhì)家族。其中，Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子是較為保守的家族之一，最近越來越多的研究顯示該家族的某些成員參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。 Hespintor是應(yīng)用抑制性差減扣除雜交技術(shù)研究了乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式調(diào)節(jié)靶基因，從肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2中篩選得到一未知功能新基因，經(jīng)RT-PCR驗證后，結(jié)合生物信息學(xué)確定該基因?qū)儆谝环N新的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子（GenBank Accession：DQ438947）。同源分析表明，Hespintor具有與食管癌相關(guān)基因2（esophageal cancer related gene 2，ECRG2）高度同源的serpin基本結(jié)構(gòu)。由于ECRG2具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等作用，因此提示Hespintor可能也具有抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的能力。Hespintor與包括ECRG2在內(nèi)的其它Kazal家族成員在基本結(jié)構(gòu)上既有相似性又有獨特性，它在細(xì)胞中的生物學(xué)功能以及抗腫瘤作用有待于深入研究。 UniGene數(shù)據(jù)庫從屬于GeneBank數(shù)據(jù)庫，專門收集非冗余性的基因來源的clusters數(shù)據(jù)。每一個UniGene Cluster代表單一基因的序列和相關(guān)的信息，例如基因表達的組織類型和染色體圖譜定位信息。除了這些具有特征的序列以外，成千上萬的EST也被收錄在內(nèi)。因此，這些相應(yīng)收集的資源可以作為基因發(fā)現(xiàn)的來源。當(dāng)前，Unigene已收錄了多個物種的序列，選擇這些物種是因為它們有大量的EST可用數(shù)據(jù)，即Unigene數(shù)據(jù)庫完全是以實驗體系為基礎(chǔ)建立起來的。分析發(fā)現(xiàn)，Hespintor基因在正常組織中有表達，但在腫瘤細(xì)胞（除生殖細(xì)胞瘤外）中不表達，強烈提示Hespintor的表達缺失可能與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。 生物信息學(xué)是以生物大分子為研究對象，以計算機為工具，運用數(shù)學(xué)和信息科學(xué)的觀點理論和方法，去研究生命現(xiàn)象、組織和分析呈指數(shù)級增長的生物信息數(shù)據(jù)的一門科學(xué)。伴隨計算機網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展而產(chǎn)生，其強大的功能使其已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的重要手段。目前，基因和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫呈現(xiàn)幾何級數(shù)增長，需要生物與計算機技術(shù)緊密結(jié)合的生物信息學(xué)對其進行分析，以闡明生物的本質(zhì)，因此生物信息學(xué)研究重點體現(xiàn)在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)兩個方面。該系統(tǒng)由數(shù)據(jù)庫、計算機網(wǎng)絡(luò)和應(yīng)用軟件三大部分組成，其關(guān)注的研究熱點包括：序列對比、基因識別、DNA序列分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和分子進化研究。 利用ExPASy系統(tǒng)預(yù)測Hespintor，蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，該蛋白僅由螺旋和折疊組成，不涉及轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。繼續(xù)的預(yù)測表明，Hespintor具有信號肽，屬于分泌蛋白，與其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞外的預(yù)測結(jié)果相符。當(dāng)然，在對目的基因及其編碼蛋白信息一無所知的情況下，包括結(jié)構(gòu)與功能、表達與調(diào)控、生物學(xué)功能與醫(yī)學(xué)意義，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對目的基因進行分析具有重要的指導(dǎo)意義，為進一步的實驗研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。盡管如此，所有預(yù)測結(jié)果仍然需要實驗來最終驗證。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的強弱與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶降解ECM及基膜的能力密切相關(guān)，抑制這些蛋白酶活性，就有可能影響腫瘤的進程，成為治療腫瘤的有效方法。Hespintor是一種新發(fā)現(xiàn)的Kazal型人類絲氨酸蛋白酶抑制因子，可能具有抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的能力。為此我們克隆了Hespintor基因，并進行生物信息學(xué)分析，為進一步探究其生物學(xué)功能及其在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移機制中的可能作用提供實驗依據(jù)。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- Hespintor具有與食管癌相關(guān)基因2（ECRG2）高度同源的serpin基本結(jié)構(gòu)。由于ECRG2具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等作用，因此提示Hespintor可能也具有抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的能力。Hespintor與包括ECRG2在內(nèi)的其它Kazal家族成員在基本結(jié)構(gòu)上既有相似性又有獨特性，它在細(xì)胞中的生物學(xué)功能以及抗腫瘤作用有待于深入研究。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 腫瘤細(xì)胞水解細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟，需要一系列的蛋白酶參與。腫瘤細(xì)胞分泌的尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA，一種絲氨酶蛋白酶）是腫瘤局部浸潤和/或形成遠處轉(zhuǎn)移的限速步驟。因此，干預(yù)uPA水平或功能可以達到治療腫瘤的目的，其中以Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子抑制uPA活性最為直接也最具有臨床應(yīng)用前景。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：克隆人絲氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因，并應(yīng)用生物信息學(xué)對其進行分析。方法：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，擴增獲得Hespintor基因片段，插入至TA克隆載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，藍白斑法篩選陽性克隆菌落，進行菌落PCR及雙酶切提取質(zhì)粒，測序鑒定。然后登錄ExPASy對其進行分析。結(jié)果：克隆得到Hespintor基因，其染色體定位于5q33.1，在正常組織中有表達，但在腫瘤細(xì)胞（除生殖細(xì)胞瘤外）中不表達；蛋白僅由螺旋和折疊組成，含有信號肽和一個糖基化部位，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞外。結(jié)論：成功克隆了Hespintor基因，分析發(fā)現(xiàn)其屬于Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子家族中的一個分泌型新成員。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- [1] J Virol. 2010; 84(2):907-17. [2] Cancer. 2007 May 15;109(10):2142-53. [3] J Gastroenterol. 2006; 41(9):832-836. [4] Arch Biochem Biophys. 2008; 479(2):153-157. [5] Carcinogenesis. 2007; 28(11):2274-2281.
同類課題研究水平概述
- 1、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子的結(jié)構(gòu) Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子一般是由一個或多個重復(fù)保守的Kazal結(jié)構(gòu)域所組成。典型的Kazal結(jié)構(gòu)域通常是由50～60個氨基酸殘基組成，其中包括6個半胱氨酸殘基和一個較為保守的序列模型。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子家族成員多為小分子多肽，其中某些成員能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，影響細(xì)胞因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分子的表達，從而成為腫瘤治療的新靶點。 2、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子家族的主要成員 2.1 胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑（PSTI） PSTI又稱絲氨酸蛋白酶抑制因子KazalⅠ型，是最早分離鑒定的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子家族成員之一，能抑制胰蛋白酶和其它絲氨酸蛋白酶。PSTI的主要功能是保持消化道粘膜的完整性，避免粘膜被胰蛋白酶等過度消化。如果PSTI活性改變，容易形成潰瘍等消化道疾病，成為進一步癌變的基礎(chǔ)。因此，PSTI活性的保持對于預(yù)防消化道腫瘤具有重要影響。 2.2 腫瘤相關(guān)的胰酶抑制劑（TATI） TATI為己經(jīng)應(yīng)用于臨床診斷的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子。多種癌癥的患者血清及尿液中的TATI濃度明顯升高，因此TATI作為分子標(biāo)志物被用于臨床診斷參考。TATI作為serpin通過與上述蛋白酶的作用可抑制ECM的降解，進而抑制腫瘤的增殖、侵潤和轉(zhuǎn)移，還能抑制可溶性Ⅰ型膠原的降解，并且直接抑制MMP前體的激活。由此推斷，TATI通過參與膠原降解的級聯(lián)酶解網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，抑制腫瘤細(xì)胞的侵潤和轉(zhuǎn)移。 2.3 反向誘導(dǎo)富含半胱氨酸帶有Kazal模體的蛋白（RECK） RECK在多種人類組織和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中表達，但在腫瘤細(xì)胞系及惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中不表達。它能夠與MMP9結(jié)合并抑制其活性，提示RECK可通過MMP9參與腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移。動物實驗中，表達RECK的纖維母細(xì)胞瘤的血管生成啟動被強烈抑制，提示其可抑制腫瘤的血管形成。以上研究表明RECK表達下降將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性演進，因而被認(rèn)為是潛在的抑癌基因。 2.4 食管癌相關(guān)基因2多肽（ECRG2） ECRG2是近年來由我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一種Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子，其mRNA在正常人的食管中表達而在食管癌細(xì)胞中表達下調(diào)。食管癌細(xì)胞系單獨轉(zhuǎn)染ECRG2基因能夠抑制細(xì)胞的增殖，而阻斷其表達則對細(xì)胞增殖的抑制作用消失
