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基本信息
- 項目名稱：
- 四種臨床應(yīng)用材料對牙齦成纖維細胞的毒性研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 體外試驗表明，現(xiàn)今臨床口腔修復(fù)合金材料釋放出的金屬離子存在抑制細胞增殖等毒性作用的缺陷。本實驗通過MTT比色法測鎳鉻、鈷鉻、金鈀合金、氧化鋯四種材料吸光度值，計算細胞相對增殖率。并通過流式細胞儀法測定不同材料浸提液中培養(yǎng)的人牙齦成纖維細胞不同增殖周期時相的DNA百分含量，計算細胞的增殖指數(shù)百分比，最終得出此4種材料的細胞毒性大小，發(fā)現(xiàn)氧化鋯對牙齦細胞損傷最小，很好地解決了合金材料對牙齦損傷的問題。
- 詳細介紹：
- 鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）作為臨床口腔修復(fù)領(lǐng)域最常用的材料，對其生物相容性的研究在口腔修復(fù)學(xué)和材料學(xué)中始終占有十分重要的地位。很多研究發(fā)現(xiàn)，合金在口腔中可以析出金屬離子，在戴用含合金修復(fù)體患者的唾液、口腔軟組織(如牙齦、舌刮片)中檢測到相關(guān)金屬離子濃度升高。體外試驗表明，牙科合金釋放出的金屬離子具有降低細胞代謝、抑制細胞增殖等毒性作用。本實驗選擇國內(nèi)十多家加工廠常用的4種德國進口鑄造合金，用四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測法和流式細胞儀測量法，檢測并比較其對人牙齦成纖維細胞的毒性作用，選出最為優(yōu)越的口腔修復(fù)材料。 本實驗采用材料及試劑為：鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）（Germany），人牙齦成纖維細胞HGF（ATCC，USA）；96孔板、細胞培養(yǎng)瓶（NUNC，丹麥）；胰蛋白酶、DMEM（高糖）培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清FBS等均為美國Thermo Scientific HyClone產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司； 無水乙醇、飽和酚（平衡酚、tris-Hcl）等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。 主要儀器和設(shè)備為：酶標(biāo)儀（Thermo electron corporation，USA）；倒置顯微鏡（Nikon，日本）；CO2孵箱（Thermo Lab systems，USA）；低速離心機（科大創(chuàng)新），流式細胞儀（BD，USA）。 具體實驗方法如下: 1.鑄造合金浸提液的制備 將4種合金鑄造成直徑6 mm,高3 mm的圓柱體,每種合金10個試樣。用蒸餾水超聲波清洗10 min,于高溫高壓(103. 42kPa、121℃)條件下滅菌處理20 min。按細胞培養(yǎng)液(浸提介質(zhì))與試樣表面積之比為1 ml/cm2的標(biāo)準(zhǔn)在37℃、5% CO2、濕度95%的無菌條件下浸提72 h作為浸提液。 2 人牙齦成纖維細胞HGF傳代培養(yǎng) 利用含10%胎牛血清的DMEM，加雙抗（100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素）培養(yǎng)HGF。在CO2孵箱中，在37℃、5% CO2、濕度95%的無菌條件下培養(yǎng)2-3天，根據(jù)細胞的生長情況及培養(yǎng)液的顏色變化換液, 待培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，細胞鋪滿瓶底90%后傳代。去掉原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基緩慢清洗培養(yǎng)瓶中細胞，加1ml胰蛋白酶消化，置于孵箱中1-2min,用等量的培養(yǎng)基中和，并用加液槍吹打，將細胞吹打下來。將液體抽取出置于離心管中，以1000r/min離心10min。去掉上清液，加入2ml培養(yǎng)基吹打均勻，將含有細胞的培養(yǎng)液平均分在兩個培養(yǎng)瓶中，再在每個培養(yǎng)瓶中分別加入2ml培養(yǎng)基，放入CO2孵箱中培養(yǎng)（整個過程無菌操作）。 3 MTT比色法檢測臨床應(yīng)用材料對牙齦成纖維細胞的毒性 將實驗分為陰性對照組、陽性對照組、鎳鉻合金、金鉑合金組(含89.4%黃金)、鈷鉻合金組、氧化鋯全瓷組,每組6復(fù)孔。每孔內(nèi)分別接種細胞懸液(密度為3000個/m1) 100μl，以含10%胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照,在37℃、5% CO2、濕度95%條件下培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁生長。用含50%材料浸提液的新鮮培養(yǎng)液交換試管中原培養(yǎng)液,陰性對照以新鮮培養(yǎng)液交換,陽性對照組加入8 ml/L的苯酚溶液10μl。分別在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至2、4、7 d，每孔加入10μl MTT(5 mg/ml)溶液,置于37℃、飽和濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后取出,倒出96孔板中的液體，加入DMSO溶解。用酶標(biāo)檢測儀在492nm波長下測定各孔吸光度(A)值,并計算細胞相對增殖率(relative growth rate, RGR)，公式:RGR=(實驗組A值/陰性對照組A值)×100%。根據(jù)RGR值評定材料毒性程度級別。 結(jié)論：MTT實驗方法只是通過檢測線粒體的一種酶的活性變化來評估材料的細胞毒性，并不反映細胞其它功能狀況。從MTT比色法結(jié)果分析，細胞增殖指數(shù)依次為鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷），氧化鋯組對牙齦成纖維細胞的損傷率最小。而鎳鉻合金組在后四組材料浸提液組中對牙齦成纖維細胞的損傷率最大，但均比陽性對照組的損傷率小。 4 流式細胞儀法（FCM）檢測臨床應(yīng)用材料對牙齦成纖維細胞的毒性 取細胞懸液(密度為1×105個/ml)3 ml加入45 ml培養(yǎng)瓶中37℃培養(yǎng)72 h，使細胞生長進入旺盛期。以含50%四種臨床應(yīng)用材料浸提液的新鮮培養(yǎng)液交換瓶內(nèi)液體,陽性對照組加入含300μl飽和酚培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)2d。中止培養(yǎng)。 （1）用無血清1640培養(yǎng)基清洗2次（瓶內(nèi)細胞），洗去細胞碎片。 （2）用胰酶徹底消化（使細胞分散成單個，無細胞團）再用等量的培養(yǎng)基中和，離心（800r/min，5min）。 （3）離心后去除上清液，再用無血清的1640培養(yǎng)基3ml洗兩次（吹打，離心）。 （4）離心后去除上清液，留500μl 1640培養(yǎng)基用200μl的搶緩慢混勻。 （5）緩慢加5ml的4℃預(yù)冷75%的乙醇，則得到濃度為70%-75%之間的濃度，再用500μl的搶混勻（7次左右）。利用流式細胞儀試劑盒采用流式細胞儀測定細胞各增殖周期時相的DNA百分含量。 細胞增殖指數(shù)=(S+G2M) /(G0G1+S+G2M)。 結(jié)論：流式細胞儀法從分子水平評價合金的細胞毒性,鎳鉻合金的增殖指數(shù)最小，對牙齦成纖維細胞HGF的損傷程度最大；而氧化鋯（烤瓷）組的增殖指數(shù)最大對牙齦成纖維細胞HGF的損傷程度最小。 MTT比色法和流式細胞儀檢測結(jié)果均提示氧化鋯抑制率最小，而鎳鉻合金的抑制指數(shù)最大；鎳鉻合金的細胞毒性略大于另三種材料，但均在臨床應(yīng)用的允許范圍內(nèi)。 本實驗的意義在于：現(xiàn)如今合金材料廣泛地用于牙科的冠橋修復(fù)、可摘局部義齒支架和烤瓷牙的基底金屬。但由于其具有潛在的毒性和致癌性，越來越多的學(xué)者對合金的生物相容性提出質(zhì)疑。本實驗通過選擇4種臨床應(yīng)用材料和人牙齦成纖維細胞進行細胞毒性試驗，利用MTT比色法及流式細胞儀法(FCM)驗證并評價4種材料的細胞毒性，證明氧化鋯陶瓷材料對牙齦細胞損傷最小，本實驗使體外細胞培養(yǎng)對機體內(nèi)環(huán)境的模擬更趨真實，試驗結(jié)果更為準(zhǔn)確與客觀。有研究表明氧化鋯具有密度高強度高的特點，抗破裂性及破裂后強韌的固化性能，是一種優(yōu)秀的高科技生物材料，生物相容性好，優(yōu)于各種金屬合金，包括黃金。氧化鋯對牙齦無刺激、無過敏反應(yīng)，很適合應(yīng)用于口腔，避免了金屬在口腔內(nèi)產(chǎn)生的過敏、刺激、腐蝕等不良反應(yīng)，彌補了合金材料對牙齦損傷的缺點，此實驗項目為氧化鋯在口腔修復(fù)應(yīng)用中的安全性提供了可靠的依據(jù)。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）為臨床口腔修復(fù)領(lǐng)域最常用的材料。研究發(fā)現(xiàn)，合金在口腔中可以析出金屬離子，同時體外實驗表明釋放出的金屬離子具有降低細胞代謝、抑制細胞增殖等毒性作用。本實驗選擇4種德國進口鑄造合金，用四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測法和流式細胞儀測量法，檢測和比較四種合金對人牙齦成纖維細胞的毒性作用，為臨床選擇高安全性鑄造合金提供實驗支持。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯為口腔修復(fù)領(lǐng)域最常用的臨床材料，口腔內(nèi)這4種材料析出的金屬離子直接與牙齦接觸，而用人牙齦成纖維細胞進行這4種臨床應(yīng)用材料進行細胞毒性試驗報道較少見。本研究選擇此4種材料和上述細胞進行細胞毒性試驗，使體外細胞培養(yǎng)對機體內(nèi)環(huán)境的模擬更趨真實，實驗結(jié)果更為準(zhǔn)確與客觀。利用MTT比色法及流式細胞儀法進一步驗證來評價4種材料的細胞毒性，以選擇出臨床更為安全的材料。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 氧化鋯陶瓷材料是目前使用較廣的一種全瓷口腔修復(fù)材料，它具有密度高強度高的特點，具有抗破裂性及破裂后強韌的固化性能。并且它是一種優(yōu)秀的高科技生物材料，生物相容性好，優(yōu)于各種金屬合金，包括黃金。氧化鋯對牙齦無刺激、無過敏反應(yīng)，很適合應(yīng)用于口腔，避免了金屬在口腔內(nèi)產(chǎn)生的過敏、刺激、腐蝕等不良反應(yīng)。本實驗應(yīng)用細胞學(xué)方法在細胞水平證明了氧化鋯陶瓷材料的優(yōu)越性，為其作為口腔修復(fù)材料提供更廣闊的前景。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 采用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法，測定人牙齦成纖維細胞在鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）4種臨床應(yīng)用材料的浸提液中培養(yǎng)不同時間（2、4、7天）的吸光度值，計算細胞的相對增殖率(RGR)；并采用流式細胞儀法測定以上四種材料浸提液中培養(yǎng)的人牙齦成纖維細胞不同增殖周期時相中DNA相對百分含量，計算細胞的增殖指數(shù)百分比。意在檢測鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）4種臨床應(yīng)用材料的細胞毒性。通過上述兩種方法測定4種合金對牙齦成纖維細胞毒性結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)氧化鋯（烤瓷）對牙齦細胞損傷最小，證明其具有良好的生物相容性及安全性等優(yōu)于其他合金的性能，很好地解決了合金材料對牙齦損傷這一難題，為其作為口腔修復(fù)材料提供了更廣闊的前景。
獲獎情況
- 本實驗獲得大連醫(yī)科大學(xué)第五屆大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品大賽 二等獎
鑒定結(jié)果
- 本實驗為作者及合作者獨立完成，構(gòu)思新穎，實驗精巧，數(shù)據(jù)真實可信，且具有極強的現(xiàn)實意義。
參考文獻
- 四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測法和流式細胞儀測量法檢測和比較其對人牙齦成纖維細胞的毒性作用 Scott A，Egner W，Gawkrodger DJ，et a1．The national survey of adverse reactions to dental materials in the UK：A preliminary study by the UK Adverse Reactions Reporting Project[J]．Br Dent J，2004，196(8)：471—477． Faccioni F，F(xiàn)ranceschetti P，Cerpelloni M，et a1．In vivo study on metal release from fixed orthodontic appliances and DNA damage in oral mucosa cells[J]．Am J Orthod Dentofacial Orthop，2003，124(6)：687—693 張幗，黃翠，張智星，等．牙本質(zhì)粘結(jié)劑對人牙髓細胞毒性的體外研究.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，21：808 吳建紅，文輝，趙剛，等．含關(guān)木通血清對人腎小管上皮細胞增殖周期的影響．醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，26：1134
同類課題研究水平概述
- 從20世紀(jì)90年代起越來越多學(xué)者根據(jù)材料植入體內(nèi)的不同部位及不同的應(yīng)用目的，選擇不同部位和組織來源的細胞作為試驗細胞。鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）4種口腔修復(fù)領(lǐng)域最常用的臨床材料，口腔內(nèi)這4種材料析出的金屬離子直接與牙齦接觸，而用人牙齦成纖維細胞進行這4種臨床應(yīng)用材料進行細胞毒性試驗報道較少見。鎳鉻合金廣泛地用于牙科的冠橋修復(fù)、可摘局部義齒支架和烤瓷牙的基底金屬。由于鎳和鎳化合物都有潛在的毒性和致癌性，越來越多的學(xué)者對鎳的生物相容性提出質(zhì)疑Faccioni等發(fā)現(xiàn)，在戴固定矯治器的患者頰黏膜中，鎳和鉻的濃度分別是正常人的3.4和2.8倍，金屬濃度和口腔黏膜細胞活力有明顯的負相關(guān)。而氧化鋯陶瓷材料是目前使用較廣的一種全瓷口腔修復(fù)材料，它具有密度高強度高的特點，具有抗破裂性及破裂后強韌的固化性能。并且它是一種優(yōu)秀的高科技生物材料，生物相容性好，優(yōu)于各種金屬合金，包括黃金?，F(xiàn)有研究表明氧化鋯對牙齦無刺激、無過敏反應(yīng)，很適合應(yīng)用于口腔，避免了金屬在口腔內(nèi)產(chǎn)生的過敏、刺激、腐蝕等不良反應(yīng)。 本實驗基于以上國內(nèi)外研究成果，利用MTT及流式細胞儀法，采用以上四種應(yīng)用普遍的臨床口腔修復(fù)應(yīng)用材料對人牙齦成纖維細胞進行細胞毒性試驗探究。
