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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 快速診斷副豬嗜血桿菌的PCR檢測(cè)試劑盒的研究與應(yīng)用
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本研究的目的在于：建立副豬嗜血桿菌早期PCR診斷方法，并以此為基礎(chǔ)研制早期診斷試劑盒。實(shí)現(xiàn)在感染早期（菌血癥時(shí)期）對(duì)該病原菌的準(zhǔn)確診斷，以指導(dǎo)臨床上早期給藥治療，有效降低該病的發(fā)病率與死亡率。
- 詳細(xì)介紹：
- 副豬嗜血桿菌所致疾病是近年來(lái)嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的細(xì)菌性傳染病, 在健康豬群中呈暴發(fā)性流行,HPS宿主性很強(qiáng)，只感染豬，感染豬主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，通常見(jiàn)于5～8周齡，可以影響從2周齡到4月齡的生長(zhǎng)豬，發(fā)病率一般在10％～15％，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50％，對(duì)全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。副豬嗜血桿菌主要引起多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和胸膜炎等，目前的檢測(cè)方法只能在感染中后期確診該病，且多數(shù)臨床藥物無(wú)法在漿膜形成有效濃度，因而治療效果極差。本研究的目的在于：在建立副豬嗜血桿菌早期PCR診斷方法的基礎(chǔ)上，研制出診斷試劑盒用于副豬嗜血桿菌的早期診斷，在感染初期（菌血癥時(shí)期）對(duì)該病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，以指導(dǎo)早期給藥治療，降低該病的發(fā)病率與死亡率。 本試驗(yàn)是基于Hps的外膜蛋白（omp）基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性擴(kuò)增引物，預(yù)擴(kuò)增片段是414bp，建立的一種更加特異，對(duì)模板要求更低的PCR檢測(cè)方法，通過(guò)各種條件優(yōu)化，研制成標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試劑盒。具體思路如下： 根據(jù)GenBank中已發(fā)布Hps外膜蛋白（omp）基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性擴(kuò)增引物，預(yù)擴(kuò)增片段是414bp。以試驗(yàn)室保存的Hps血清4型標(biāo)準(zhǔn)菌株制備細(xì)菌基因組模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到與預(yù)擴(kuò)增片斷大小相符414bp左右目的條帶，回收測(cè)序，并通過(guò)BLAST與GenBank中已發(fā)布序列進(jìn)行比對(duì)，建立特異PCR檢測(cè)方法。通過(guò)人工感染健康仔豬，感染后不同時(shí)期采集鼻腔拭子與血液樣本進(jìn)行臨床樣品檢測(cè)，以確定該方法用于Hps早期感染的可行性；同時(shí)檢測(cè)結(jié)果還可初步探索分析副豬嗜血桿菌的排毒規(guī)律，為制定了合理的檢測(cè)程序及疾病控制提供參考。 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)各項(xiàng)條件優(yōu)化，并通過(guò)敏感性、可重復(fù)性、特異性、穩(wěn)定性和保存條件等研究，為研制針對(duì)Hps早期感染的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試劑盒。在試驗(yàn)室檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行臨床樣品的檢測(cè)，驗(yàn)證試劑盒用于生產(chǎn)的可行性，并與文獻(xiàn)中已報(bào)道的副豬嗜血桿菌試劑盒進(jìn)行比較。 本試驗(yàn)的關(guān)鍵在于特異性引物的設(shè)計(jì)和目的片段擴(kuò)增；Hps感染模型的復(fù)制及早期PCR檢測(cè)方法的建立；試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化研究；臨床樣本的檢測(cè)及同類技術(shù)比較。
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作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 本研究的目的在于：建立副豬嗜血桿菌早期PCR診斷方法，并以此為基礎(chǔ)研制早期診斷試劑盒。實(shí)現(xiàn)在感染早期（菌血癥時(shí)期）對(duì)該病原菌的準(zhǔn)確診斷，以指導(dǎo)臨床上早期給藥治療，有效降低該病的發(fā)病率與死亡率。 本試驗(yàn)的關(guān)鍵在于特異性引物的設(shè)計(jì)和目的片段擴(kuò)增；Hps感染模型的復(fù)制及早期PCR檢測(cè)方法的建立；試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化研究；臨床樣本的檢測(cè)及同類技術(shù)比較。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1、本試驗(yàn)最大的創(chuàng)新點(diǎn)在于建立了一種靈敏的副豬嗜血桿菌PCR診斷方法，并在此基礎(chǔ)上研制了相應(yīng)的試劑盒,能夠在感染初期（菌血癥時(shí)期）對(duì)該病原進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，以指導(dǎo)早期給藥治療，降低該病的發(fā)病率與死亡率。 2、本試驗(yàn)還選取我國(guó)副豬嗜血桿菌多種流行血清型進(jìn)行該P(yáng)CR檢測(cè)試劑盒的測(cè)試，均能擴(kuò)增出414bp左右的目的條帶，此試劑盒在國(guó)內(nèi)可進(jìn)行推廣。 3、方法簡(jiǎn)便可行，與同類技術(shù)比較有較高實(shí)用性。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本試驗(yàn)建立的診斷方法彌補(bǔ)了目前診斷方法的不足，實(shí)現(xiàn)了早期診斷，在此基礎(chǔ)上研制的試劑盒使用方便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可以批量生產(chǎn)，以便用于臨床上早期診斷。通過(guò)進(jìn)行臨床樣品的檢測(cè)和同類技術(shù)比較試驗(yàn)，說(shuō)明本試驗(yàn)研制的試劑盒比現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性率更高，樣品的保存方法更合理，并且通過(guò)探索副豬嗜血桿菌的排毒規(guī)律，確定了臨床上感染的最佳檢測(cè)時(shí)間，使該試劑盒能夠在生產(chǎn)中推廣普及。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的 建立副豬嗜血桿菌早期診斷方法，從而研制早期檢測(cè)試劑盒，并進(jìn)行初步應(yīng)用。方法 根據(jù)GenBank中已發(fā)布Hps外膜蛋白（omp）基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性擴(kuò)增引物，預(yù)擴(kuò)增片段為414bp；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行試劑盒的研制，并通過(guò)敏感性、可重復(fù)性、特異性、精密性、穩(wěn)定性和保存條件等研究，為實(shí)現(xiàn)該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考；人工感染健康仔豬并設(shè)立對(duì)照，感染后不同時(shí)期采集鼻腔拭子與血液樣本進(jìn)行臨床樣品檢測(cè)；通過(guò)采集四川境內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)呼吸癥狀和發(fā)燒癥狀的仔豬鼻腔分泌物和前腔靜脈樣品各300份，用本試驗(yàn)研制的試劑盒和現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增片段為414bp；試劑盒在活菌數(shù)大于425cfu/mL時(shí)能進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，批內(nèi)和批間檢測(cè)無(wú)差異，在—20℃條件下保存較為穩(wěn)定；人工感染仔豬，在感染后2d~10d能夠從鼻腔拭子檢測(cè)到該菌感染，在感染后2d~4d血液中該菌的檢測(cè)率高達(dá)100%；檢測(cè)300份臨床樣品，結(jié)果顯示，本試驗(yàn)研制的試劑盒陽(yáng)性率明顯高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的試劑盒。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)所研制的試劑盒敏感性高,特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性較好，能快速診斷Hps，為更好地預(yù)防、控制該病的發(fā)生提供技術(shù)保障。
獲獎(jiǎng)情況
- 1、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)第七屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽終審決賽中獲得特等獎(jiǎng) 2、論文待發(fā)表
鑒定結(jié)果
- 論文待發(fā)表，暫無(wú)
參考文獻(xiàn)
- [1] 張盼鋒，仇微，等．副豬嗜血桿菌PCR快速診斷方法的建立[J]．廣東畜牧獸醫(yī)科技，2009，34(1)：33-34． [2] 林雪玲，黃耿森，冼瓊珍，等．副豬嗜血桿菌分離鑒定與PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(3)：321-323． [3] 萬(wàn)世平，王建，葛菲菲，等．副豬嗜血桿菌PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30(1)：9-12． [4] 萬(wàn)世平，卓國(guó)榮，姜法銘，等．副豬嗜血桿菌病診斷方法的研究進(jìn)展[J]．養(yǎng)豬學(xué)報(bào)，2009，(6)：68-70． [5]KimJ，ChungH，JungT．Post weaning systemic wasting syndrome of pig sin Korea：prevalence，microscopic lesions and coexisting micro organisms[J ]．Vet Med Sci，2002，64：57-62． [6] Amano H，Shibata M，Kajio N，et a1．Pathologic observations of pigs intranasally inoculated with serovar1，4 and 5 of Heamophilus parasuis using immunoperoxidase method[J]．Vet Med Sci，1994，56(4)：639-644． [7]Kielstein P，Rapp—Gabrielson V J．Designation of 15 serovars ofttaemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion usingheat—stable antigen extracts[J]．Clin Microbiol，1992，30：826-865．
同類課題研究水平概述
- 副豬嗜血桿菌病是近年來(lái)嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的新發(fā)細(xì)菌性傳染病，在健康豬群中呈暴發(fā)性流行，只感染豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，發(fā)病率一般在10％～15％，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50％。在我國(guó)，Hps在各豬場(chǎng)引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，目前常用的診斷方法主要有病原學(xué)和血清學(xué)方法。病原學(xué)方法主要是細(xì)菌的分離和鑒定，但是由于本菌對(duì)培養(yǎng)條件較為苛刻，且比較脆弱，從病料中分離率低。血清學(xué)方法主要有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、ELISA等，但血清學(xué)診斷結(jié)果不一致并且不準(zhǔn)確。更重要的是上述方法只能在感染中后期確診該病，多數(shù)臨床藥物無(wú)法在漿膜形成有效濃度，治療效果極差。如果能在早期對(duì)該病進(jìn)行確診，早期給藥，治愈率很高。所以，建立一種早期、快速、準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)生產(chǎn)具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)研究的PCR特異性擴(kuò)增引物是根據(jù)根據(jù)GenBank中已發(fā)布的Hps外膜蛋白（omp）基因設(shè)計(jì)的，擴(kuò)增片段為414bp，較之目前普遍使用的16S特異性引物（擴(kuò)增片段為822bp），特異性更高，對(duì)模板要求更粗略，能檢測(cè)到細(xì)菌濃度更低，即在活菌數(shù)大于425cfu/ml 時(shí)檢測(cè)到清晰的目的條帶，可用于在感染初期（菌血癥時(shí)期）對(duì)Hps進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，達(dá)到早期診斷的目的。在此方法基礎(chǔ)上研制的試劑盒使用方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、可重復(fù)性和穩(wěn)定性好。本研究對(duì)養(yǎng)豬業(yè)預(yù)防和控制副豬嗜血桿菌病具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。 針對(duì)Hps在豬群中的廣泛傳播而對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的巨大危害，國(guó)內(nèi)外近年來(lái)也一直致力于對(duì)豬嗜血桿菌病的研究。目前，已取得了突破性進(jìn)展，但仍不夠成熟，各種檢測(cè)技術(shù)尚存在一定的局限性，需要進(jìn)一步的優(yōu)化。 本研究通過(guò)與目前普遍使用的16S特異性引物相比較，設(shè)計(jì)一種特異性更強(qiáng)，對(duì)模板要求更加粗略的特異性引物，建立副豬嗜血桿菌PCR早期診斷方法，并研制出快速檢測(cè)試劑盒，同時(shí)試劑盒進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，使其能夠在生產(chǎn)中得到推廣應(yīng)用。 今后的進(jìn)一步研究可以建立在副豬嗜血桿菌排毒規(guī)律探索的基礎(chǔ)之上，進(jìn)行感染豬體溫變化對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性率的影響研究，以制定一套科學(xué)的臨床檢測(cè)程序，為本試劑盒的推廣提供理論依據(jù)。
