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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 用于蛋白間互作研究的雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）操作平臺的構(gòu)建及應(yīng)用
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 雙分子熒光互補(bǔ)是利用綠色熒光蛋白產(chǎn)生的熒光驗(yàn)證蛋白之間的互作、檢測其互作強(qiáng)弱以及定位蛋白互作位點(diǎn)的一項(xiàng)新技術(shù).本研究針對已有的BiFC載體缺陷進(jìn)行改造. 同時，將應(yīng)用改造后載體平臺對番茄CIPKs和CBLs蛋白互作展開研究，結(jié)果番茄中CBLs與CIPKs的互作并非與擬南芥完全相同，可能調(diào)控不同的抗逆反應(yīng)，為進(jìn)一步開展番茄CBLs與CIPKs的功能研究提供線索.
- 詳細(xì)介紹：
- 雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是利用綠色熒光蛋白產(chǎn)生的熒光驗(yàn)證蛋白之間的互作、檢測其互作強(qiáng)弱以及定位蛋白互作位點(diǎn)的一項(xiàng)新技術(shù). 本研究針對已有的BiFC載體構(gòu)建過程復(fù)雜、所用工具酶為稀有酶及連接困難等問題，對BiFC進(jìn)行改造. 結(jié)果表明，改造后的BiFC平臺操作便利、快捷，假陽性出現(xiàn)機(jī)率低，可用于蛋白間互作分析. 通過該平臺，進(jìn)一步開展了番茄CBLs與CIPKs間互作研究，各CBLs與CIPKs組合間均能產(chǎn)生互作，但互作強(qiáng)弱程度差異較大. 特別值得關(guān)注的是，擬南芥AtCBL1與AtCIPK23互作可激活鉀離子通道，但LeCBL1和LeCIPK23互作很弱，與預(yù)期不符，表明番茄中CBLs與CIPKs的互作并非與擬南芥完全相同，可能調(diào)控不同的抗逆反應(yīng)，為進(jìn)一步開展番茄CBLs與CIPKs的功能研究提供線索.
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 研究目的：本研究旨在擴(kuò)展雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）技術(shù)在植物分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用。 基本思路：分別克隆35S 啟動子和終止子，插入到pCAMBIA1301雙元表達(dá)載體合適位置，構(gòu)建pCAMBIA1301-35ST載體；消除pCAMBIA1301-35ST載體中的部分酶切位點(diǎn)；分別以BiFC載體pSAT1-cEYFP-C1-B和pSAT4-nEYFP-C1質(zhì)粒為模板，克隆相應(yīng)的cEYFP盒和nEYFP盒，分別構(gòu)建pCAMBIA1301-cEYFP -35ST和pCAMBIA1301-nEYFP-35ST載體。 創(chuàng)新點(diǎn)：原有的BiFC載體在構(gòu)建過程中存在克隆過程復(fù)雜、所用工具酶為稀有酶，以及不易連接成功等問題，本小組的創(chuàng)新在于對原BiFC載體進(jìn)行改造，消除原載體上的稀有酶切位點(diǎn)，增加實(shí)驗(yàn)室常用的一些限制酶切位點(diǎn)，便于目的基因進(jìn)行熒光互補(bǔ)觀察。 技術(shù)關(guān)鍵：消除pCAMBIA1301-35ST載體中的部分稀有酶切位點(diǎn)；增加實(shí)驗(yàn)室常用的一些限制酶切位點(diǎn)。 主要技術(shù)指標(biāo)：（1）構(gòu)建pCAMBIA1301-cEYFP -35ST和pCAMBIA1301-nEYFP-35ST載體，用實(shí)驗(yàn)室常用的一些限制酶切位點(diǎn)替代原載體上的稀有酶切位點(diǎn)。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 蛋白質(zhì)功能的表現(xiàn)通常通過蛋白質(zhì)的相互作用完成，即某一個蛋白質(zhì)的功能表型，要通過與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)。蛋白互作是細(xì)胞中的一項(xiàng)基本生理作用，發(fā)生在所有亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器中的每一個生理過程。目前，蛋白互作的研究已經(jīng)是研究生命活動的一個熱點(diǎn)方向。免疫共沉淀、表面等離子共振，以及酵母雙雜交技術(shù)是較為傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)互作研究手段，但不能有效開展活體研究。 利用熒光蛋白發(fā)光原理可有效檢測蛋白在活體內(nèi)的互作，現(xiàn)有雙分子熒光蛋白互補(bǔ) 和熒光共振能量轉(zhuǎn)移 兩種方法。本小組在原有的BiFC技術(shù)基礎(chǔ)上，針對其載體克隆過程復(fù)雜、所用工具酶為稀有酶，以及不易連接成功等問題開展了一系列的攻關(guān)，新的改良載體已經(jīng)成功替換了稀有的工具酶，以常用的工具酶為代替，克服了不易連接成功的問題；同時載體骨架的改變也克服了克隆過程復(fù)雜，有利于實(shí)驗(yàn)室后續(xù)研究的進(jìn)展。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- 1. 本項(xiàng)目曾在2010 年參加由浙江省大學(xué)生科技競賽委員會主辦的浙江省第二屆大學(xué)生生命 科學(xué)競賽，并獲得一等獎。 2. 省科技廳2010 年度浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目“雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)研究番 茄CBL1 與CIPK23 的互作”（2010R404005）。 3. 本項(xiàng)目曾獲浙江師范大學(xué)第四屆“挑戰(zhàn)杯”課外學(xué)術(shù)科技作品競賽一等獎。
作品所處階段
- 實(shí)驗(yàn)室階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 有償轉(zhuǎn)讓
作品可展示的形式
- 圖片 樣品
使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測
- 蛋白互作是細(xì)胞中的一項(xiàng)基本生理作用，發(fā)生在所有亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器中的每一個生 理過程。闡明蛋白質(zhì)的相互作用在何時、何地發(fā)生以及蛋白質(zhì)復(fù)合物如何形成，能為確定蛋 白質(zhì)生物學(xué)作用提供決定性線索。目前，蛋白互作的研究已經(jīng)是研究生命活動的一個熱點(diǎn)方 向。 BiFC 技術(shù)是近年來發(fā)展的研究目標(biāo)蛋白是否具有相互作用的一項(xiàng)新技術(shù)。與常用的研究 蛋白互作的免疫共沉淀、表面等離子共振、酵母雙雜交技術(shù)相比，BiFC 技術(shù)簡單直觀，無需 試劑檢測，假陽性率低，從而能更好的推斷出目標(biāo)蛋白是否發(fā)生了相互作用。現(xiàn)有研究表明 BiFC 技術(shù)能廣泛應(yīng)用于許多結(jié)構(gòu)、功能不同的蛋白互作與修飾的研究。該技術(shù)在不同實(shí)驗(yàn)室 也已廣泛的應(yīng)用于不同的細(xì)胞株與有機(jī)體，并未發(fā)現(xiàn)在任何實(shí)驗(yàn)材料系統(tǒng)出現(xiàn)不適用。本實(shí) 驗(yàn)小組開發(fā)的BiFC 改良載體將以載體形式轉(zhuǎn)讓于其他實(shí)驗(yàn)室，以其改良后的優(yōu)勢逐漸替代原 有BiFC 載體的市場。目前，蛋白互作已成為研究的熱點(diǎn)，因而改良載體具有很好的社會效益。
同類課題研究水平概述
- 下村修等從水母體內(nèi)分離純化得到綠色熒光蛋白，馬丁·查爾菲等首次在大腸桿菌中成功表達(dá)了能夠產(chǎn)生綠色熒光的GFP。 目前，GFP的應(yīng)用已經(jīng)涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)等多個學(xué)科。作為報(bào)告基因，GFP被廣泛的應(yīng)用于亞細(xì)胞定位、蛋白互作等諸多體系中，成為重要的研究手段。而蛋白互作是細(xì)胞中的一項(xiàng)基本生理作用，利用GFP發(fā)光原理可有效檢測蛋白在活體內(nèi)的互作，現(xiàn)有雙分子熒光蛋白互補(bǔ)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移兩種方法。 BiFC是基于GFP發(fā)光原理來驗(yàn)證蛋白之間的互作、檢測其互作強(qiáng)弱以及定位蛋白互作位點(diǎn)的一項(xiàng)新技術(shù)。將GFP在特定的位點(diǎn)切開，形成不發(fā)熒光的N端和C端，分別連接到2個有相互作用的靶蛋白，在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)或體外混合這2個融合蛋白時，由于靶蛋白的相互作用，熒光蛋白的2個片段在空間上互相靠近互補(bǔ)，重新構(gòu)建成完整的具有活性的熒光蛋白分子。 現(xiàn)有研究表明BiFC 技術(shù)能廣泛應(yīng)用于許多結(jié)構(gòu)、功能不同的蛋白互作與修飾的研究。該技術(shù)在不同實(shí)驗(yàn)室也已廣泛的應(yīng)用于不同的細(xì)胞株與有機(jī)體，并未發(fā)現(xiàn)在任何實(shí)驗(yàn)材料系統(tǒng)出現(xiàn)不適用。 BiFC 系統(tǒng)雖然出現(xiàn)較晚，但迅速獲得應(yīng)用。目前雙分子熒光互補(bǔ)標(biāo)記技術(shù)在蛋白互作研究應(yīng)用中 主要涉及于轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用及其亞細(xì)胞定位，G 蛋白以及α 和β 亞基之間的互相作用，各類蛋白家族以及相關(guān)伴侶蛋白之間的互相作用，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，酶-底物復(fù)合物的確定，蛋白復(fù)合物定位調(diào)節(jié)，涉及轉(zhuǎn)錄后修飾的互作，監(jiān)視新的互作蛋白，大分子復(fù)合物和分子骨架等 。這些蛋白質(zhì)在傳統(tǒng)的研究中因?yàn)闂l件的限制曾存在種種猜測和質(zhì)疑，但隨著BiFC 技術(shù)在研究中的應(yīng)用，各種猜測也漸漸地得到了解決，尤其是蛋白家族以及相關(guān)伴侶蛋白之間的互相作用的研究。傳統(tǒng)的研究對于伴侶蛋白的研究一直存在空白，盡管存在種種跡象證明它的存在，但卻沒有一種直接的手段觀察或提取到伴侶蛋白。利用BiFC 技術(shù)我們可以直接在熒光顯微鏡下觀察到伴侶蛋白的生物過程，這也有利于我們對蛋白家族或群體協(xié)作的研究。 盡管BiFC 技術(shù)仍具有許多難以克服的缺陷，但我們必須承認(rèn)雙分子熒光互補(bǔ)標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)為我們 蛋白質(zhì)互作的研究打開了新的道路。并且隨著BiFC 技術(shù)的完善，更加合適的GFP 變異的出現(xiàn)，蛋白 質(zhì)互作的研究將會得到更好的發(fā)展。
