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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 流感嗜血桿菌血清型與耐藥性關(guān)系及其機(jī)制研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本課題組對(duì)臨床分離的399株流感嗜血桿菌臨床株進(jìn)行了血清分型、耐藥表型和耐藥機(jī)制研究，同時(shí)進(jìn)行了莢膜基因檢測(cè)，以期闡明流感嗜血桿菌的主要耐藥模式、主要血清分型及主要耐藥機(jī)制別，為臨床流感嗜血桿菌感染的經(jīng)驗(yàn)治療和疫苗的預(yù)防接種取向提供有價(jià)值的參考依據(jù)，也為該菌耐藥株的鑒定和莢膜分型提供快速檢測(cè)方法。
- 詳細(xì)介紹：
- 流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae,Hi）是人類社區(qū)獲得性肺炎的最常見病原菌之一，還常常引起兒童中耳炎、上呼吸道感染等疾病。Hi根據(jù)細(xì)胞壁外莢膜多糖的有無(wú)，分為有莢膜的可分型和無(wú)莢膜的不可分型兩類，前者可分為a,b,c,d,e,f六個(gè)血清型，常引起侵襲性疾病。但近年研究發(fā)現(xiàn)，隨著Hib菌苗的廣泛接種，有莢膜菌株已少見，不可分型菌株已成為主流菌型。不同型別的Hi引起的常見疾病種類不同。因此Hi所致疾病與血清分型有密切關(guān)系。對(duì)于Hi治療，氨芐西林是歷史沿襲的首選藥物。世界各Hi 菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率正以較快的速度上升，而且不同地區(qū)差異很大。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Hi不定型株的耐藥率高于有莢膜菌株的趨向，進(jìn)行Hi血清分型和細(xì)菌耐藥機(jī)制研究對(duì)于該菌臨床流行病學(xué)研究和感染的經(jīng)驗(yàn)治療均有重要意義。因此，本課題組對(duì)臨床分離的399株流感嗜血桿菌臨床株進(jìn)行了血清分型、耐藥表型和耐藥機(jī)制研究，同時(shí)進(jìn)行了莢膜基因檢測(cè)，以期闡明流感嗜血桿菌的主要耐藥模式、主要血清分型及主要耐藥機(jī)制別，為臨床流感嗜血桿菌感染的經(jīng)驗(yàn)治療和疫苗的預(yù)防接種取向提供有價(jià)值的參考依據(jù)，也為該菌耐藥株的鑒定和莢膜分型提供快速檢測(cè)方法。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：對(duì)臨床分離的399株Hi臨床株進(jìn)行血清分型、耐藥表型和耐藥機(jī)制研究，同時(shí)進(jìn)行莢膜基因檢測(cè)，以期闡明流感嗜血桿菌的主要耐藥模式、主要血清分型及主要耐藥機(jī)制別，為臨床流感嗜血桿菌感染的經(jīng)驗(yàn)治療和疫苗的預(yù)防接種取向提供有價(jià)值的參考依據(jù)。 思路：E-test法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，玻片凝集法進(jìn)行血清分型，Cefinase紙片測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶，PCR擴(kuò)增耐藥基因、莢膜基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本項(xiàng)目緊密結(jié)合臨床,通過(guò)對(duì)Hi血清型和莢膜基因分型檢測(cè)的比對(duì)研究及菌株耐藥表型和耐藥機(jī)制研究，闡明本地區(qū)Hi以不定型株為主，菌株耐氨芐西林機(jī)制主要是產(chǎn)生TEM基因，針對(duì)TEM基因的PCR擴(kuò)增有助于快速確定Hi對(duì)氨芐西林的耐藥性。研究中還建立了應(yīng)用莢膜基因檢測(cè)對(duì)菌株進(jìn)行分型的方法，具有良好的科學(xué)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值。在國(guó)內(nèi)現(xiàn)有文獻(xiàn)中，未見關(guān)于流感嗜血桿菌耐藥性、菌株分型和耐藥機(jī)制關(guān)系的研究報(bào)道。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本課題研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):兒童分離的Hi以不定型株為主，且不定型株比例逐年增高，菌株對(duì)氨芐西林的耐藥率逐年增加，其耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶，且均為TEM產(chǎn)酶機(jī)制，3歲以上個(gè)體來(lái)源的菌株產(chǎn)酶率高于3歲以下組；不定型株對(duì)氨芐西林的耐藥性高于可分型株；bexA-PCR可快速區(qū)分菌株型別。上述結(jié)果對(duì)Hi感染的經(jīng)驗(yàn)治療、耐藥性和菌型的快速判斷以及b型菌苗的接種價(jià)值評(píng)價(jià)具有科學(xué)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- Hi是人類社區(qū)獲得性肺炎最常見病原菌之一，根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁外莢膜多糖的有無(wú)，分為可分型和不可分型兩類，前者分為a、b、c、d、e、f六個(gè)血清型。近年來(lái)，世界各Hi菌株對(duì)氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素及復(fù)方新諾明的耐藥率正以較快的速度上升，但不同地區(qū)菌型分布和耐藥性特點(diǎn)差異巨大。本研究應(yīng)用Etest法和K-B法完成菌株的藥敏試驗(yàn)，用玻片凝集法完成菌株血清分型，用頭孢硝噻吩法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶，用PCR技術(shù)檢測(cè)菌株的耐藥相關(guān)基因TEM和 ROB，并應(yīng)用多重PCR對(duì)Hi進(jìn)行莢膜基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兒童分離的流感嗜血桿菌以不可分型株為主，占61.9%-94.73%，且不可分型株比例有逐年增高趨勢(shì)，菌株對(duì)氨芐西林的耐藥率逐年增加，耐氨芐西林的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶，且均為TEM產(chǎn)酶機(jī)制，3歲以上個(gè)體來(lái)源的菌株產(chǎn)酶率高于3歲以下組；不可分型菌株對(duì)氨芐西林的耐藥性高于可分型株；bexA-PCR可快速區(qū)分菌株型別。本研究可為臨床流感嗜血桿菌感染的經(jīng)驗(yàn)治療和疫苗的預(yù)防接種取向提供有價(jià)值的參考，也為該菌耐藥株的鑒定和莢膜分型提供快速檢測(cè)方法，具有科學(xué)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值。
獲獎(jiǎng)情況
- 《流感嗜血桿菌耐藥模式監(jiān)測(cè)及耐藥機(jī)制研究》于2011年3月發(fā)表在中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志第34卷第3期。 《流感嗜血桿菌血清型與耐藥性關(guān)系及其機(jī)制研究》獲2011年杭州師范大學(xué)第十二屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽一等獎(jiǎng)。 《流感嗜血桿菌血清型與耐藥性關(guān)系及其機(jī)制研究》獲2010年浙江省新苗人才計(jì)劃立項(xiàng)。 《流感嗜血桿菌耐藥機(jī)制研究》獲2010年杭州師范大學(xué)第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽三等獎(jiǎng)。
鑒定結(jié)果
- 情況屬實(shí)。
參考文獻(xiàn)
- 現(xiàn)有技術(shù)： （1）V因子、X因子和V+X因子試驗(yàn)鑒定流感嗜血桿菌。 （2）Kirby-Bauer法檢測(cè)流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的敏感性， E-test法檢測(cè)氨芐西林的最低抑菌濃度。 （3）Cefinase紙片按說(shuō)明書測(cè)定菌株的β-內(nèi)酰胺酶。 （4）玻片凝集法進(jìn)行血清分型。 （5）多重聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增DNA，瓊脂糖凝膠電泳加凝膠成像系統(tǒng)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。 （6）SPSS13.0版分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢測(cè)。 技術(shù)文獻(xiàn)檢索目錄： 1．錢夏婧，景偉興，馮旭敏等.流感嗜血桿菌耐藥模式監(jiān)測(cè)及耐藥機(jī)制研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（3）1-3. 2.錢夏婧，華春珍.不定型流感嗜血桿菌的研究進(jìn)展[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，11（7）740-745. 3.程薇，錢利強(qiáng)，華春珍等.兒童呼吸道標(biāo)本分離的流感嗜血桿菌耐藥模式研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,25(3)192-195. 4.錢利強(qiáng),程薇,華春珍等. 流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥性及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志,2009,34(2)69-73. 5.裘益輝，張艷，華春珍，等.杭州市上呼吸道感染患兒分離的流感嗜血桿菌分離株的血清分型及其對(duì)氨芐西林的耐藥性分析[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2009,11（3）217-220. 6.張艷,裘益輝,華春珍等. 流感嗜血桿菌分型的研究進(jìn)展[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2009,10(5)430-433.
同類課題研究水平概述
- Hi對(duì)氨芐西林耐藥率逐年增高給治療帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。國(guó)內(nèi)、外現(xiàn)已運(yùn)用血清學(xué)和分子生物學(xué)等諸多方法檢測(cè)Hi及其分型，并對(duì)Hi的耐藥率實(shí)施監(jiān)測(cè)，為臨床循證診斷和合理指導(dǎo)應(yīng)用抗生素提供了有力依據(jù)。PCR指紋圖是利用引物與模板的復(fù)性位點(diǎn)的特異選擇擴(kuò)增多態(tài)性的DNA，用一條引物在較低溫度下與模板復(fù)性，在模板適當(dāng)位置相對(duì)延伸，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段，經(jīng)電泳后即可見擴(kuò)增片段形成的DNA指紋圖，又稱DNA多態(tài)性的隨機(jī)擴(kuò)增 (RAPD)，可用于流行病學(xué)調(diào)查，尤其在檢測(cè)變異株形成及耐藥性變化等方面，并能檢測(cè)血清學(xué)分型株之間的基因多態(tài)性。Peerbooms等通過(guò)RAPD方法檢測(cè) 259名日托兒童鼻咽部Hi攜帶株發(fā)現(xiàn)，39%的兒童(37/95)在2周后第2次檢測(cè)顯示攜帶Hi，大部分?jǐn)y帶的Hi是與2周前第1次檢測(cè)到基因型的不同，且其中有 40%的兒童攜帶株與第1次檢測(cè)中其他陽(yáng)性兒童Hi基因型相同，提示兒童鼻咽部攜帶的Hi是短暫和不斷變化的，不同基因型Hi可在兒童間快速傳播。Tenover等使用 PCR法檢測(cè)腦脊液中Hi的同時(shí)，用基因探針檢測(cè)耐氨芐西林的基因，可進(jìn)一步區(qū)分其中的氨芐西林耐藥菌株，為臨床治療提供指導(dǎo)。Hassan-King等則采用復(fù)合PCR法，采用兩對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增，在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)肺炎患兒血培養(yǎng)標(biāo)本中Hi和肺炎鏈球菌，并與血培養(yǎng)法結(jié)果比較，提示復(fù)合PCR法是檢測(cè)血標(biāo)本中這兩種病原菌的敏感方法，是一種試圖提高檢測(cè)率的成功嘗試。近年來(lái)還有學(xué)者通過(guò)巢式聚合酶鏈反應(yīng)( nested-PCR)檢測(cè)Hib。姜敏等運(yùn)用nested-PCR與玻片凝集法檢測(cè)Hib及氨芐西林耐藥株。在74株通過(guò) E-test證實(shí)對(duì)氨芐西林耐藥的健康兒童鼻咽部攜帶的Hi中，用 nested- PCR發(fā)現(xiàn)2株有b型特異性莢膜基因陽(yáng)性，與玻片凝集法結(jié)果一致，判斷為Hib。提示nested-PCR b型莢膜檢測(cè)法可作為玻片凝集法的一個(gè)重要補(bǔ)充。國(guó)外對(duì)耐氨芐西林Hi產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的分子機(jī)制研究，主要是在大量培養(yǎng)細(xì)菌的基礎(chǔ)上，通過(guò)CsCl密度梯度超離心等方法獲取較大量質(zhì)粒DNA，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析、瓊脂糖凝膠電泳、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗(yàn)等，大致分析質(zhì)粒DNA的大小、結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證質(zhì)粒介導(dǎo)的耐氨芐西林表型等，獲得質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)酶及其與耐氨芐西林藥物的關(guān)系等的可靠證據(jù)。
