基本信息
- 項(xiàng)目名稱:
- 中國(guó)蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及部分ESTs分析
- 來(lái)源:
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類:
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介:
- 本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建大連蛇島蝮蛇毒腺全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)上,對(duì)部分序列進(jìn)行隨機(jī)克隆和ESTs測(cè)序,通過(guò)與NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、查詢和注釋,對(duì)獲得的195個(gè)有效序列進(jìn)行分析。該全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建成功以及部分ESTs序列的獲得,為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達(dá)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。今后可以利用所構(gòu)建的GSSG-cDNA文庫(kù),在大規(guī)模測(cè)序的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步開展蛇島蝮蛇功能基因的研究。
- 詳細(xì)介紹:
- 一.材料與方法 1.材料與試劑 GSS由遼寧蛇島老鐵山自然保護(hù)區(qū)管理處提供;Poly (A) PuristTM 試劑盒、DNA Marker、TaKaRa RNAiso Reagent、載體、各種限制性內(nèi)切酶、宿主細(xì)胞為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit為Clontech公司產(chǎn)品。EB、苯酚為Sigma 公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。 2.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建采用SMART技術(shù),以pDNR-LIB為載體,E. coli DH10B為宿主菌構(gòu)建中國(guó)蛇島蝮蛇毒腺的cDNA文庫(kù)。 3.cDNA克隆的序列測(cè)定1.cDNA文庫(kù)菌液的擴(kuò)增 2.cDNA文庫(kù)質(zhì)粒的提取 4.ESTs的獲得與分析 獲得的文庫(kù)質(zhì)粒序列用Chromas 剔除pDNR-LIB載體序列以及包含的接頭序列,得到每個(gè)克隆的EST序列信息,再通過(guò)Stackpack軟件將獲得的序列進(jìn)行拼接,獲得UniGenes,通過(guò)NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast X檢索和序列比對(duì),分析基因的功能并將其分類,對(duì)應(yīng)的克隆保存、備用。 二.結(jié)果與分析 1. cDNA文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè) 以pDNR-LIB為載體,構(gòu)建了GSSG-cDNA文庫(kù),其原始文庫(kù)庫(kù)容量為8×107 cfu/mL,隨機(jī)從文庫(kù)中挑選單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定表明,大多數(shù)插入片段均大于1000 bp,表明所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)是高質(zhì)量的。這是我國(guó)第一個(gè)GSSG-cDNA文庫(kù)。 2. cDNA文庫(kù)質(zhì)粒鑒定 cDNA文庫(kù)用堿裂解法提取質(zhì)粒,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所得到的電泳圖表明我們已構(gòu)建了完整的GSSG-cDNA文庫(kù)。 三.實(shí)驗(yàn)意義 本實(shí)驗(yàn)中,全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建成功以及部分ESTs序列的獲得,為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達(dá)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。 今后可以利用所構(gòu)建的GSSG-cDNA文庫(kù),在大規(guī)模測(cè)序的基礎(chǔ)上,通過(guò)EST序列分析等手段進(jìn)一步開展蛇島蝮蛇功能基因研究。蛇毒中含有多種酶類和多肽,這些物質(zhì)和酶類不僅具有很強(qiáng)的毒理作用,而且還具有治癌、抗凝、止血、鎮(zhèn)痛等作用,具有很高的藥用和醫(yī)用價(jià)值,因而引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的普遍重視,在臨床應(yīng)用中發(fā)揮著極其重要的作用,并且具有較高的經(jīng)濟(jì)效益,因此具有很高的開發(fā)價(jià)值,是一個(gè)值得開拓、前景廣闊的領(lǐng)域。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的:構(gòu)建大連蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫(kù),在大規(guī)模測(cè)序的基礎(chǔ)上,獲得ESTs標(biāo)簽,為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達(dá)和功能研究打下基礎(chǔ)。 基本思路:(1)構(gòu)建大連蛇島蝮蛇毒腺的cDNA文庫(kù)(GSSG-cDNA); (2)cDNA克隆測(cè)序; (3)ESTs標(biāo)簽的獲得與分析
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 采用SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù),保證了cDNA序列信息的完整性。該方法簡(jiǎn)便易行,獲得全長(zhǎng)基因的幾率大,同時(shí)也可以獲得低豐度表達(dá)基因。ESTs序列的獲得,為進(jìn)一步開展蛇島蝮功能基因研究打下基礎(chǔ)。而且,這是我國(guó)第一個(gè)GSSG-cDNA文庫(kù),具有首創(chuàng)性。能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)目前人們尚不知道的基因,拓寬對(duì)蛇毒的認(rèn)識(shí),為進(jìn)一步開發(fā)蛇島蝮蛇的毒液組分的藥物功能奠定了基礎(chǔ),應(yīng)用前景廣闊。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 利用所構(gòu)建的GSSG-cDNA文庫(kù),對(duì)GSS蛋白活性組分進(jìn)行基因克隆、蛋白表達(dá)和功能研究,進(jìn)而研發(fā)有效藥物,應(yīng)用于臨床。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 摘要:采用SMART(Switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技術(shù),構(gòu)建了中國(guó)蛇島蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensis, GSS)毒腺(GSSG)的cDNA(GSSG-cDNA)文庫(kù)。經(jīng)測(cè)定,構(gòu)建的GSSG-cDNA庫(kù)容量為8×10^7 cfu/mL,大多數(shù)插入片段均大于1000 bp,結(jié)果表明GSSG-cDNA文庫(kù)已構(gòu)建成功。對(duì)隨機(jī)挑選的200個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定,獲得有效序列195個(gè)。通過(guò)與NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast X比對(duì)分析,得到84個(gè)克隆為已知功能基因,17個(gè)克隆為未知功能基因,94個(gè)克隆為新基因,分別占有效序列的43.1%、8.7%和48.2%。該全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建成功以及部分ESTs序列的獲得,為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達(dá)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞:蛇島蝮;cDNA文庫(kù);ESTs
獲獎(jiǎng)情況
- 2011年4月獲得大連醫(yī)科大學(xué)第五屆大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文一等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- 技術(shù):(1)SMART技術(shù);(2)通過(guò)生物信息學(xué)Chromas和Stackpack軟件獲得ESTs,并通過(guò)NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和序列比對(duì)。 檢索目錄:[1]表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)在基因組學(xué)研究中的應(yīng)用。生物技術(shù)通報(bào) 2004; 1:34-38. [2] 劉淑清,馬馳,宗軍衛(wèi),等。雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜初步分析蛇島蝮蛇毒蛋白質(zhì)組。動(dòng)物學(xué)雜志2009; 44(4):70-77.
同類課題研究水平概述
- 蛇毒是毒蛇腺體中分泌出來(lái)的一種毒液,含有復(fù)雜的蛋白質(zhì)毒素,其成分是蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì),還含有多種重要的酶類,這些物質(zhì)和酶類不僅具有很強(qiáng)的毒理作用,而且還具有治癌、抗凝、止血、鎮(zhèn)痛等作用,具有很高的藥用和醫(yī)用價(jià)值,因而引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的普遍重視,并進(jìn)行了許多研究工作。 國(guó)際上,一種新型抗蛇毒血清新藥在法國(guó)研制成功;日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了蛇毒阻礙血液凝固的機(jī)制,在蛇毒中天然存在的有抗凝固作用的蛋白質(zhì),它在開發(fā)和設(shè)計(jì)新的抗血液凝固劑時(shí)有著重要的利用價(jià)值;美國(guó)科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)蛇毒中的蛋白質(zhì)具有抗癌作用。 目前,我國(guó)醫(yī)學(xué)界和生物學(xué)界的研究課題主要有三個(gè)研究方面:一是蛇毒的化學(xué)成分和毒、藥理作用的研究;二是抗蛇毒血清的研究;三是蛇毒應(yīng)用的研究。隨著蛇毒研究事業(yè)的蓬勃發(fā)展,我國(guó)對(duì)蛇毒研究和臨床應(yīng)用的進(jìn)展很快,并取得了可喜的成果。例如:昆明動(dòng)物研究所從浙江蝮蛇毒中提純的磷酸二酯酶,該產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到了國(guó)外同類產(chǎn)品的先進(jìn)水平;中國(guó)醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究室從蛇島的蝮蛇和江浙蝮蛇毒中分離出"蛇毒抗栓酶";解放軍二三八醫(yī)院與沈陽(yáng)藥學(xué)院合作,從東北陸生的蝮蛇毒中分離出"清栓酶"制劑;貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)現(xiàn)TMAC-1可通過(guò)酶切補(bǔ)體特定成分抑制補(bǔ)體活性;廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院證實(shí)從白眉蝮蛇蛇毒中提取出的細(xì)胞毒素H1有抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠胃癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用等。 蛇毒中含有多種酶類和多肽,在臨床應(yīng)用中發(fā)揮著極其重要的作用,并且具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。因此具有很高的開發(fā)價(jià)值,是一個(gè)值得開拓、前景廣闊的領(lǐng)域。