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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 中國蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫的構(gòu)建及部分ESTs分析
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建大連蛇島蝮蛇毒腺全長cDNA文庫的基礎(chǔ)上，對部分序列進(jìn)行隨機(jī)克隆和ESTs測序，通過與NCBInr數(shù)據(jù)庫比對、查詢和注釋，對獲得的195個(gè)有效序列進(jìn)行分析。該全長cDNA文庫的構(gòu)建成功以及部分ESTs序列的獲得，為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達(dá)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。今后可以利用所構(gòu)建的GSSG-cDNA文庫，在大規(guī)模測序的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展蛇島蝮蛇功能基因的研究。
- 詳細(xì)介紹：
- 一．材料與方法 1.材料與試劑 GSS由遼寧蛇島老鐵山自然保護(hù)區(qū)管理處提供；Poly (A) PuristTM 試劑盒、DNA Marker、TaKaRa RNAiso Reagent、載體、各種限制性內(nèi)切酶、宿主細(xì)胞為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit為Clontech公司產(chǎn)品。EB、苯酚為Sigma 公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。 2.cDNA文庫的構(gòu)建采用SMART技術(shù)，以pDNR-LIB為載體，E. coli DH10B為宿主菌構(gòu)建中國蛇島蝮蛇毒腺的cDNA文庫。 3.cDNA克隆的序列測定1.cDNA文庫菌液的擴(kuò)增 2.cDNA文庫質(zhì)粒的提取 4.ESTs的獲得與分析 獲得的文庫質(zhì)粒序列用Chromas 剔除pDNR-LIB載體序列以及包含的接頭序列，得到每個(gè)克隆的EST序列信息，再通過Stackpack軟件將獲得的序列進(jìn)行拼接，獲得UniGenes，通過NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast X檢索和序列比對，分析基因的功能并將其分類，對應(yīng)的克隆保存、備用。 二．結(jié)果與分析 1. cDNA文庫質(zhì)量檢測 以pDNR-LIB為載體，構(gòu)建了GSSG-cDNA文庫，其原始文庫庫容量為8×107 cfu/mL，隨機(jī)從文庫中挑選單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定表明，大多數(shù)插入片段均大于1000 bp，表明所構(gòu)建的cDNA文庫是高質(zhì)量的。這是我國第一個(gè)GSSG-cDNA文庫。 2. cDNA文庫質(zhì)粒鑒定 cDNA文庫用堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。所得到的電泳圖表明我們已構(gòu)建了完整的GSSG-cDNA文庫。 三．實(shí)驗(yàn)意義 本實(shí)驗(yàn)中，全長cDNA文庫的構(gòu)建成功以及部分ESTs序列的獲得，為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達(dá)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。 今后可以利用所構(gòu)建的GSSG-cDNA文庫，在大規(guī)模測序的基礎(chǔ)上，通過EST序列分析等手段進(jìn)一步開展蛇島蝮蛇功能基因研究。蛇毒中含有多種酶類和多肽，這些物質(zhì)和酶類不僅具有很強(qiáng)的毒理作用，而且還具有治癌、抗凝、止血、鎮(zhèn)痛等作用，具有很高的藥用和醫(yī)用價(jià)值，因而引起國內(nèi)外醫(yī)藥界的普遍重視，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮著極其重要的作用，并且具有較高的經(jīng)濟(jì)效益,因此具有很高的開發(fā)價(jià)值，是一個(gè)值得開拓、前景廣闊的領(lǐng)域。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：構(gòu)建大連蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫，在大規(guī)模測序的基礎(chǔ)上，獲得ESTs標(biāo)簽，為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達(dá)和功能研究打下基礎(chǔ)。 基本思路:(1)構(gòu)建大連蛇島蝮蛇毒腺的cDNA文庫（GSSG-cDNA)； (2)cDNA克隆測序； (3)ESTs標(biāo)簽的獲得與分析
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 采用SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫，保證了cDNA序列信息的完整性。該方法簡便易行，獲得全長基因的幾率大，同時(shí)也可以獲得低豐度表達(dá)基因。ESTs序列的獲得，為進(jìn)一步開展蛇島蝮功能基因研究打下基礎(chǔ)。而且，這是我國第一個(gè)GSSG-cDNA文庫，具有首創(chuàng)性。能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)目前人們尚不知道的基因，拓寬對蛇毒的認(rèn)識，為進(jìn)一步開發(fā)蛇島蝮蛇的毒液組分的藥物功能奠定了基礎(chǔ)，應(yīng)用前景廣闊。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 利用所構(gòu)建的GSSG-cDNA文庫，對GSS蛋白活性組分進(jìn)行基因克隆、蛋白表達(dá)和功能研究，進(jìn)而研發(fā)有效藥物，應(yīng)用于臨床。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 摘要：采用SMART(Switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技術(shù)，構(gòu)建了中國蛇島蝮蛇（Gloydius shedaoensis shedaoensis, GSS）毒腺(GSSG)的cDNA(GSSG-cDNA)文庫。經(jīng)測定，構(gòu)建的GSSG-cDNA庫容量為8×10^7 cfu/mL，大多數(shù)插入片段均大于1000 bp，結(jié)果表明GSSG-cDNA文庫已構(gòu)建成功。對隨機(jī)挑選的200個(gè)克隆進(jìn)行序列測定，獲得有效序列195個(gè)。通過與NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast X比對分析，得到84個(gè)克隆為已知功能基因，17個(gè)克隆為未知功能基因，94個(gè)克隆為新基因，分別占有效序列的43.1%、8.7%和48.2%。該全長cDNA文庫的構(gòu)建成功以及部分ESTs序列的獲得，為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達(dá)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：蛇島蝮；cDNA文庫；ESTs
獲獎(jiǎng)情況
- 2011年4月獲得大連醫(yī)科大學(xué)第五屆大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文一等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- 技術(shù)：(1)SMART技術(shù);(2)通過生物信息學(xué)Chromas和Stackpack軟件獲得ESTs，并通過NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和序列比對。 檢索目錄:[1]表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）在基因組學(xué)研究中的應(yīng)用。生物技術(shù)通報(bào) 2004; 1:34-38. [2] 劉淑清，馬馳，宗軍衛(wèi)，等。雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜初步分析蛇島蝮蛇毒蛋白質(zhì)組。動(dòng)物學(xué)雜志2009; 44(4):70-77.
同類課題研究水平概述
- 蛇毒是毒蛇腺體中分泌出來的一種毒液，含有復(fù)雜的蛋白質(zhì)毒素，其成分是蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，還含有多種重要的酶類，這些物質(zhì)和酶類不僅具有很強(qiáng)的毒理作用，而且還具有治癌、抗凝、止血、鎮(zhèn)痛等作用，具有很高的藥用和醫(yī)用價(jià)值，因而引起國內(nèi)外醫(yī)藥界的普遍重視，并進(jìn)行了許多研究工作。 國際上，一種新型抗蛇毒血清新藥在法國研制成功；日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了蛇毒阻礙血液凝固的機(jī)制，在蛇毒中天然存在的有抗凝固作用的蛋白質(zhì)，它在開發(fā)和設(shè)計(jì)新的抗血液凝固劑時(shí)有著重要的利用價(jià)值；美國科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)蛇毒中的蛋白質(zhì)具有抗癌作用。 目前，我國醫(yī)學(xué)界和生物學(xué)界的研究課題主要有三個(gè)研究方面：一是蛇毒的化學(xué)成分和毒、藥理作用的研究；二是抗蛇毒血清的研究；三是蛇毒應(yīng)用的研究。隨著蛇毒研究事業(yè)的蓬勃發(fā)展，我國對蛇毒研究和臨床應(yīng)用的進(jìn)展很快，并取得了可喜的成果。例如：昆明動(dòng)物研究所從浙江蝮蛇毒中提純的磷酸二酯酶，該產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到了國外同類產(chǎn)品的先進(jìn)水平；中國醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究室從蛇島的蝮蛇和江浙蝮蛇毒中分離出"蛇毒抗栓酶"；解放軍二三八醫(yī)院與沈陽藥學(xué)院合作，從東北陸生的蝮蛇毒中分離出"清栓酶"制劑;貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)現(xiàn)TMAC-1可通過酶切補(bǔ)體特定成分抑制補(bǔ)體活性；廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院證實(shí)從白眉蝮蛇蛇毒中提取出的細(xì)胞毒素H1有抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠胃癌生長和轉(zhuǎn)移的作用等。 蛇毒中含有多種酶類和多肽，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮著極其重要的作用，并且具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。因此具有很高的開發(fā)價(jià)值，是一個(gè)值得開拓、前景廣闊的領(lǐng)域。
