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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)及其應(yīng)用研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本項(xiàng)目利用大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori HPAG1)α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fuct)基因，構(gòu)建重組菌株，并與構(gòu)建好的另外五株菌進(jìn)行混合發(fā)酵，在體外重構(gòu)人乳巖藻糖基化寡糖的代謝合成途徑，實(shí)現(xiàn)以甘露糖為原料的人乳寡糖的規(guī)模合成，為開發(fā)新型的配方奶粉和抗黏附藥物的奠定基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 本文重點(diǎn)通過分子生物學(xué)手段對(duì)從GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)化為巖藻糖基化寡糖代謝途徑中α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶酶基因進(jìn)行了克隆，并實(shí)現(xiàn)了目的基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)；并對(duì)人乳低聚糖的體外合成做了一定的研究。主要研究結(jié)果如下： (1) 采用試劑盒法提取HPAG1的總DNA，通過PCR法獲得α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（alpha-1,2-fucosyltransferase,α-1,2-fuct）基因。得到大小為906 bp的目的基因片段，將其定向插入到原核表達(dá)載體pET-22b(+)中，得到重組表達(dá)載體pET-fuct。 (2) 將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明可表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量為35000，通過對(duì)目的蛋白的誘導(dǎo)條件進(jìn)行探索，確定最佳優(yōu)化優(yōu)化條件為：IPTG終濃度0.1mmol/L，于25℃誘導(dǎo)4h，最佳誘導(dǎo)時(shí)刻為OD600=0.8。 (3) 對(duì)所構(gòu)建的重組工程菌的酶活進(jìn)行了檢測(cè)，酶活達(dá)到了0.02 U/g (4) 利用 250 mL三角瓶發(fā)酵，工程菌混合發(fā)酵生成GDP-甘露糖，產(chǎn)量為36.36mM/L，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了MS的鑒定，在M/Z：606.1(M-H)+有離子峰。兩步混合發(fā)酵合成GDP-巖藻糖，產(chǎn)量達(dá)到36.36 mM/L。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行譜分析（MS）顯示，在M/Z：590.1(M-H)+出現(xiàn)離子峰。兩步發(fā)酵合成巖藻糖基化寡糖。產(chǎn)量達(dá)到了5.12 g/L。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究利用基因工程菌的耦合發(fā)酵中合成人乳寡糖中的α1,2-巖藻糖基化寡糖，為開發(fā)新型嬰幼兒奶粉奠定基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本項(xiàng)目為國(guó)內(nèi)首次利用組合生物學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了人乳寡糖代謝途徑的重構(gòu)，開創(chuàng)了人乳寡糖合成的新途徑；利用大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了代謝途徑中各個(gè)關(guān)鍵酶的高效表達(dá)，最大程度的提高了各中間產(chǎn)物合成量，有效的提高了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量；利用HPLC和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析和檢測(cè)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 人乳寡糖具有明顯的抗感染和某些重要的非特異性免疫學(xué)功能，也能促進(jìn)嬰兒消化道中雙歧桿菌的增殖，并使梭狀芽孢桿菌和腸球菌的數(shù)量大大減少，因此利用基因工程的方法，以甘露糖為原料生產(chǎn)人乳巖藻糖基化低聚糖，在最大程度上減少了寡糖制備的生產(chǎn)成本，達(dá)到規(guī)模制備的目的，為人乳寡糖及其類似物的制備提供了新策略。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 人乳寡糖具有明顯的抗感染等非特異性免疫學(xué)功能，能促進(jìn)嬰兒消化道中雙岐桿菌的增殖，在人乳中的含量在乳糖、脂類之后，為人乳中第三大物質(zhì)，人的初乳中寡糖含量為20-27 g/L，以巖藻糖基化寡糖為主，其中α1,2-巖藻糖在被檢人乳中占總寡糖的比例平均為73%。本研究利用基因工程菌耦合發(fā)酵合成α1,2-巖藻糖基化寡糖，為開發(fā)新型嬰幼兒奶粉奠定基礎(chǔ)。論文首先提取H.pylori HPAG1的總DNA，通過PCR法獲得906bp的α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，將其定向插入到原核表達(dá)載體pET-22b(+)中，得到表達(dá)載體pET-fuct。重組質(zhì)粒經(jīng)菌PCR、雙酶切鑒定以及序列分析，證明pET-fuct構(gòu)建成功。將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量為35000的蛋白，并確定了最佳誘導(dǎo)條件：IPTG終濃度0.1mmol/L,25°C培養(yǎng)4h，最佳誘導(dǎo)時(shí)刻為OD600=0.8，在最佳誘導(dǎo)條件下酶活達(dá)到了0.02U/g。與已經(jīng)構(gòu)建好的其它基因工程菌進(jìn)行混合發(fā)酵，α1,2-巖藻糖基化寡糖的產(chǎn)量達(dá)到了5.12g/L。
獲獎(jiǎng)情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- [1] Fanzuo Kong．Recent studies on reaction pathways and applications of sugar orthoesters in synthesis of oligosaccharides．Carbohydrate Research, 2007, 342: 345-373 [2] Koizumi，Satoshi．Large-scale production of oligosaccharides using bacterial functions [J]．Trends in Glycoscience and Glycotechnology，2003，15(82)：65-74． [3] Yazawa S，Nishimura M，Ide T，et al． Tumor-related expression of alpha1,2-fucosy- lated antigens on colorectal carcinoma cells and its suppression by cell-mediated priming using sugar acceptors for aphal1,2-fucosyhransferase[J]．Glycobiology，12(9)：545-553． [4] Sun J，Thurin HS，Cooper P，et al．Elevated ex-pression of Htype GDP-fucose：beta-D-galactoside alpha-2-L-fucosyhransferase is associated with human colon adenocarcinoma progression[J]．Proc．Nat1．Acad．Sci．1995， 92(12)： 5724-5728[5] Sambrook J，F(xiàn)ritsch Ef，Maniatis T．Molecular Cloning：A Laboratory Manual[M]．New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989．
同類課題研究水平概述
- 近年來，隨著食品工業(yè)和生物科技的快速發(fā)展，功能寡糖的開發(fā)已成為國(guó)際生物技術(shù)領(lǐng)域的重要課題，寡糖產(chǎn)業(yè)現(xiàn)已成為一個(gè)應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、化工等行業(yè)的新興重要產(chǎn)業(yè)，市場(chǎng)規(guī)模已達(dá)十余萬噸，市場(chǎng)化品種已有20余種，開發(fā)品種有近百種，現(xiàn)仍以每年10%的速度增長(zhǎng)，國(guó)外寡糖的年銷售額近5億美元，對(duì)功能特異的寡糖開發(fā)將具有更廣闊的市場(chǎng)。 目前對(duì)于低聚糖的合成主要側(cè)重于應(yīng)用化學(xué)的方法，這一方法需要復(fù)雜的保護(hù)和去保護(hù)方法，不僅合成路線復(fù)雜，而且所需的糖苷供體的價(jià)格十分的昂貴，給大批量的生產(chǎn)低聚糖帶來一定的局限性。在本項(xiàng)目中，將對(duì)巖藻糖基化低聚糖的合成代謝途徑進(jìn)行全面調(diào)控，輔以GTP過量生產(chǎn)的基因工程手段，以甘露糖為原料生產(chǎn)GDP-巖藻糖，并且與后續(xù)的巖藻糖基化轉(zhuǎn)移酶共同作用合成巖藻糖基化低聚糖，在最大程度上減少了寡糖制備的生產(chǎn)成本，達(dá)到規(guī)模制備的目的，為GDP-巖藻糖及類似糖基供體的制備提供新策略。
