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基本信息
- 項(xiàng)目名稱(chēng)：
- SAMP8快速老化小鼠泛素特異性蛋白酶USP49的羧基末端分子克隆
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類(lèi)：
- 生命科學(xué)
- 大類(lèi)：
- 自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文
- 簡(jiǎn)介：
- 本次試驗(yàn)利用Trizol一步法提取小鼠腦組織細(xì)胞中的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄、PCR技術(shù)擴(kuò)增USP49的羧基末端基因片段。將基因片段與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化到DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選試驗(yàn)確定陽(yáng)性克隆并應(yīng)用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定及序列比較分析。為進(jìn)一步研究USP49的去泛素化作用及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- SAMP8是一種從AKR/J系小鼠中通過(guò)表型選擇培育出的快速老化小鼠，表現(xiàn)為與衰老相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶缺陷。由于其較好地模擬了人類(lèi)衰老相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶障礙形成過(guò)程，是目前較理想的研究與衰老相關(guān)認(rèn)知障礙的自發(fā)性模型。 泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)ATP依賴(lài)的蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑，參與細(xì)胞凋亡、MHCⅠ類(lèi)抗原的遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義。人類(lèi)基因編碼了約95種去泛素化酶，其中泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases，USPs)家族與眾多生理及病理進(jìn)程有關(guān)。阿爾茨海默病、帕金森病等疾病患者，神經(jīng)組織內(nèi)大多含有泛素化蛋白，提示其發(fā)病均可能與USP受損有關(guān)。 USP49屬于泛素特異性蛋白酶中的一種，具體作用機(jī)制目前尚不清楚。本次試驗(yàn)利用Trizol一步法提取小鼠腦組織細(xì)胞中的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）擴(kuò)增USP49的羧基末端基因片段。將USP49的羧基末端基因片段與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化到DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選試驗(yàn)確定陽(yáng)性克隆并應(yīng)用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定及序列比較分析。為進(jìn)一步研究USP49的去泛素化作用及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為阿爾茨海默病的病因?qū)W研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。
作品專(zhuān)業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- USP49的具體作用機(jī)制目前還不清楚，本次研究從SAMP8快速老化小鼠腦組織中分離并克隆出USP49的羧基末端，為進(jìn)一步研究USP49的去泛素化作用及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為AD的病因?qū)W研究提供一定思路。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 該作品成功克隆出USP49的羧基末端，。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究SAMP8快速老化小鼠USP49的先例，本文為其研究提供了材料支撐，對(duì)推廣USP49在疾病診療中有重要意義。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- SAMP8鼠是一種比較理想的研究腦老化和癡呆的模型，亦是目前研究快速衰老的唯一哺乳類(lèi)模式動(dòng)物。此次試驗(yàn)克隆出SAMP8快速老化小鼠usp49羧基末端基因，試圖為闡明年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能改變及認(rèn)知缺陷機(jī)制奠定基礎(chǔ)并提供科學(xué)數(shù)據(jù)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 人類(lèi)細(xì)胞內(nèi)存在兩類(lèi)蛋白質(zhì)降解途徑，即溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑。人類(lèi)基因編碼了約95種去泛素化酶，其中泛素特異性蛋白酶（USPs)家族與眾多生理及病理進(jìn)程有關(guān)。阿爾茨海默病、帕金森病等疾病患者，神經(jīng)組織內(nèi)大多含有泛素化蛋白，提示其發(fā)病均可能與USP受損有關(guān)。 SAMP8快速老化小鼠是一種比較理想的研究腦老化和癡呆的模型，廣泛應(yīng)用于闡明年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能改變及認(rèn)知缺陷的基本機(jī)制。其中SAMP8亞系表現(xiàn)為衰老相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶缺陷與AD臨床表現(xiàn)非常相似。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- 1 Pickart, Eddins MJ. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biophys Acta, 2004, 1695: 55-72. 2 李楊,宋平,泛素化/去泛素化系統(tǒng)的生物化學(xué)和生物學(xué)功能。生命的化學(xué)，2006,26（6）：515-517。 3 Evans P C，Snfith T S．Lai MJ，et a1．A novel type ofdeubiquiti- nating enzyme．J Biol Chem，2003，278(25)：23180—23186． 4周偉勤，畢明剛，杜冠華，快速老化小鼠SAMP8研究進(jìn)展。中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009,25（5）：565-568。
同類(lèi)課題研究水平概述
- 泛素特異性蛋白酶USP的研究策略一般為基因的克隆、活性分析、組織分布，而分子克隆為其研究的基礎(chǔ)。人類(lèi)的54種USP大部分已被克隆，由于分子克隆技術(shù)已經(jīng)非常成熟，各研究所采取的方法都比較相近。 以往的研究多從正常大鼠、小鼠組織或cDNA文庫(kù)中克隆USP，而未考慮異常種系。SAMP8小鼠是從正常AKR/J小鼠中選擇培育出的快速老化亞系，其可較好模擬人類(lèi)衰老相關(guān)的學(xué)習(xí)障礙形成過(guò)程。 USP異常與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，因此可以推測(cè)快速老化與USP基因異常有關(guān)，從SAMP8小鼠中克隆USP家族成員基因，與正常小鼠進(jìn)行比對(duì)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致SAMP8小鼠快速老化相關(guān)基因，從而了解其形成機(jī)制，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。
