基本信息
- 項目名稱：
- 免疫組織化學(xué)雙重標記創(chuàng)新改良
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作B類
- 簡介：
- 病理研究常需在同一種細胞內(nèi)檢測兩種不同蛋白，傳統(tǒng)方法步驟繁多，組織容易脫片，導(dǎo)致實驗失敗。我們改良的創(chuàng)新點之一是將兩種不同種屬的抗體混在一起，兩抗體間無交叉反應(yīng)．特異性較高，即使細胞內(nèi)抗原量少也能檢測，從而克服了傳統(tǒng)方法因步驟繁多而致實驗失敗等缺點。創(chuàng)新點之二是首次使用DAB和4-chloro-1-naphthol組合，兩種蛋白分別顯示棕黃色和紫黑色，形成鮮明對比，特異性強，無背景染色。
- 詳細介紹：
- 在病理形態(tài)學(xué)研究及病理學(xué)醫(yī)療實踐中，經(jīng)常需要檢測兩種不同蛋白是否在同一組織或同一種細胞中共存，因此出現(xiàn)了免疫組織化學(xué)雙重標記。此方法有幾種類型，包括免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光細胞化學(xué)法結(jié)合；同一切片的再度染色法(先對第一種抗原染色，陽性部位拍照，再用酸處理使抗原抗體解離，繼之，對第二種抗原染色、拍照)；兩種酶標抗體雙重染色(分別用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶標記第二抗體．用間接法分別顯示A和B抗原)，這種方法很費時間，第一天加入第一種第一抗體后，4度過夜，第二天顯色后，經(jīng)過必要的處理，再加入第二種第一抗體，再次4度過夜，然后第二次顯色。以上過程耗時耗力，步驟繁多，組織容易脫片，導(dǎo)致實驗失敗。我們對免疫組化雙重標記改良的創(chuàng)新點之一主要是將不同種屬來源的抗體混在一起進行雙重染色，兩種抗體間無交叉反應(yīng)．特異性較高，即使細胞內(nèi)抗原量很少也能檢測。從而克服了傳統(tǒng)方法因為步驟繁多而導(dǎo)致的費時耗材甚至組織脫片，實驗最終失敗等缺點。創(chuàng)新點之二是在國內(nèi)首次使用了DAB和4-chloro-1-naphthol組合，兩種蛋白分別顯示棕黃色和紫黑色。目前國內(nèi)的石蠟組織切片雙重標記幾乎全部采用DAB和AEC兩種顯色劑，DAB為棕黃，AEC為紅色，兩種顏色反差小，染色結(jié)果不夠清晰，特異性差。我們首次選用4-chloro-1-naphthol和DAB作為石蠟組織切片的免疫組化雙標顯色劑，棕黃色和紫黑色形成鮮明對比，染色結(jié)果清晰漂亮，特異性強，無背景染色。目前正在準備試劑盒的開發(fā)。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標
- 在病理形態(tài)學(xué)研究及病理學(xué)醫(yī)療實踐中，經(jīng)常需要檢測兩種不同蛋白是否在同一組織或同一種細胞中共存，因此出現(xiàn)了免疫組織化學(xué)雙重標記。此方法有幾種類型，包括免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光細胞化學(xué)法結(jié)合；同一切片的再度染色法(先對第一種抗原染色，陽性部位拍照，再用酸處理使抗原抗體解離，繼之，對第二種抗原染色、拍照)；兩種酶標抗體雙重染色(分別用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶標記第二抗體．用間接法分別顯示A和B抗原)，這種方法很費時間，第一天加入第一種第一抗體后，4度過夜，第二天顯色后，經(jīng)過必要的處理，再加入第二種第一抗體，再次4度過夜，然后第二次顯色。以上過程耗時耗力，步驟繁多，組織容易脫片，導(dǎo)致實驗失敗。我們對免疫組化雙重標記改良的創(chuàng)新點主要是將不同種屬來源的抗體混在一起進行雙重染色，兩種抗體間無交叉反應(yīng)．特異性較高，即使細胞內(nèi)抗原量很少也能檢測。本研究的技術(shù)關(guān)鍵首先清楚兩種蛋白的細胞定位，避免在同一細胞的同一部位兩種蛋白共存，其次是根據(jù)不同的組織，采用不同的抗原修復(fù)時間，最后顯色封片后在光鏡下清楚的觀察到兩種蛋白顯示不同的顏色，特異性強，清晰無背景染色。
科學(xué)性、先進性
- 我們的改良創(chuàng)新方法，與傳統(tǒng)的方法相比，有明顯的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的方法費時費力，要經(jīng)過兩次4度過夜，從實驗開始到結(jié)束需要3天時間，敏感度差，步驟繁多，容易導(dǎo)致組織破碎、脫片，最終染色失敗。經(jīng)過創(chuàng)新改良的方法省時省力，將不同種屬來源的兩個第一抗體混在一起進行雙重染色，兩種抗體間無交叉反應(yīng)，兩種蛋白分別顯示棕黃色和紫黑色，對比鮮明，敏感度高，操作簡便，特異性強，無內(nèi)源性生物素干擾。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- 采用此改良方法的研究論文已被SCI收錄雜志接收。
作品所處階段
- 實驗室應(yīng)用階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 自行研發(fā)使用
作品可展示的形式
- 圖片
使用說明,技術(shù)特點和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟效益預(yù)測
- 改良方法： ⑴切片脫蠟至水 ⑵將切片在3%的H2O2中孵育10分鐘⑶蒸餾水沖洗 ⑷抗原修復(fù) (微波抗原修復(fù)30分鐘,PH6.0枸櫞酸鹽 緩沖液)⑸PBS沖洗，2分鐘x3次⑹即用型封閉液 滴加1滴于組織上濕盒中孵育20分鐘 ,棄去溶液，勿洗⑺小鼠來源的一抗和兔來源的一抗(合適的濃度)混勻滴加在切片上4度過夜⑻ PBS沖洗，2分鐘x3次⑼滴加二抗聚合物(分別為堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG)30分鐘⑽PBS沖洗2分鐘x3次⑾滴加DAB顯色液鏡下觀察控制顯色,蒸餾水沖洗以終止反應(yīng)，滴加4-chloro-1-naphthol顯色劑鏡下觀察控制顯色,然后水溶性封片劑封片 此方法的優(yōu)勢是省時、省力、節(jié)約試劑，實驗結(jié)果準確，清晰無背景染色，特異性強。可用于石蠟切片、冰凍切片。目前準備開發(fā)試劑盒，如能順利完成，將可為病理學(xué)基礎(chǔ)研究及臨床鑒別診斷提供簡單、快捷、高效、實用的方法并有良好的經(jīng)濟效益。
同類課題研究水平概述
- 在病理形態(tài)學(xué)研究及病理學(xué)醫(yī)療實踐中，經(jīng)常需要檢測兩種及兩種以上不同蛋白是否在同一組織或同一種細胞中共存，因此出現(xiàn)了免疫熒光多重標記，共聚焦顯微鏡下觀察。我國目前的形態(tài)學(xué)研究現(xiàn)狀是共聚焦顯微鏡的價格昂貴使用還很局限，但普通的免疫組化技術(shù)已經(jīng)遍布所有的形態(tài)學(xué)研究室及臨床病理科，因此我們本著從實際出發(fā)的原則，在普通免疫組織化學(xué)雙重標記上做了創(chuàng)新改良。 迄今為止普通免疫組化雙重標記法有幾種類型，包括免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光細胞化學(xué)法結(jié)合；同一切片的再度染色法(先對第一種抗原染色，陽性部位拍照，再用酸處理使抗原抗體解離，繼之，對第二種抗原染色、拍照)；兩種酶標抗體雙重染色(分別用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶標記第二抗體．用間接法分別顯示A和B抗原)，這種方法很費時間，第一天加入第一種第一抗體后，4度過夜，第二天顯色后，經(jīng)過必要的處理，再加入第二種第一抗體，再次4度過夜，然后第二次顯色。以上過程耗時耗力，步驟繁多，組織容易脫片，導(dǎo)致實驗失敗。我們對免疫組化雙重標記改良的創(chuàng)新點之一主要是將不同種屬來源的抗體混在一起進行雙重染色，兩種抗體間無交叉反應(yīng)．特異性較高，即使細胞內(nèi)抗原量很少也能檢測；創(chuàng)新點之二是首次使用了4-chloro-1-naphthol 作為顯色劑，4-chloro-1-naphthol顯色后為紫黑色與DAB的棕黃色形成鮮明的對比。 采用本實驗方法首先要清楚兩種蛋白的細胞定位，避免在同一細胞的同一部位兩種蛋白共存，其次是根據(jù)不同的組織，采用不同的抗原修復(fù)時間，最后顯色封片后在光鏡下清楚的觀察到兩種蛋白顯示不同的顏色，特異性強，清晰無背景染色。 我們的改良創(chuàng)新方法，與傳統(tǒng)的方法相比，有明顯的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的方法費時費力，要經(jīng)過兩次4度過夜，從實驗開始到結(jié)束需要3天時間，敏感度差，步驟繁多，容易導(dǎo)致組織破碎、脫片，最終染色失敗。經(jīng)過創(chuàng)新改良的方法省時省力，將不同種屬來源的兩個第一抗體混在一起進行雙重染色，兩種抗體間無交叉反應(yīng)，兩種蛋白分別顯示棕黃色和紫黑色，對比鮮明，敏感度高，操作簡便，特異性強，無內(nèi)源性生物素干擾。
