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基本信息
- 項目名稱：
- PiggyBac轉(zhuǎn)座子在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本項目旨在改造來自于昆蟲類的轉(zhuǎn)座子PiggyBac，經(jīng)過啟動子篩選和序列修飾，以其獲得一種高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)，從而為哺乳類動物轉(zhuǎn)基因制備和人類基因治療載體的研制奠定基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 本實驗應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)和分子克隆技術(shù)方法，將PiggyBac轉(zhuǎn)座子元件改造成適合哺乳類動物細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)基因載體。該基因載體以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因為報告基因，以新霉素抗性（Nero）基因為哺乳動物細(xì)胞抗性篩選基因。在實驗起始階段，設(shè)計引物人工合成引物序列，利用引物經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）擴(kuò)增獲得GFP基因序列。將該基因轉(zhuǎn)入克隆質(zhì)粒載體pIR-CMV。轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，進(jìn)行擴(kuò)增。然后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，獲得pIR-CMV-GFP載體，與含有PiggyBac編碼序列的載體pDNA-piggyBac，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗。實驗結(jié)果表明，以PiggyBac介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)能夠高效的表達(dá)。由此可見，經(jīng)改造的PiggyBac轉(zhuǎn)座子元件可以成為哺乳類動物細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)基因載體。這就為進(jìn)一步進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 改造來自于昆蟲類的轉(zhuǎn)座子PiggyBac，經(jīng)過啟動子篩選和序列修飾，以其獲得一種高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)，從而為哺乳類動物轉(zhuǎn)基因制備和人類基因治療載體的研制奠定基礎(chǔ)。 現(xiàn)有資料表明，轉(zhuǎn)座子具有高效的基因組間轉(zhuǎn)移功能，針對來自于昆蟲的PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行改建，從基因啟動子、靶基因序列篩選以及轉(zhuǎn)染方法等方面開展研究，探索新型高效的轉(zhuǎn)動物技術(shù)方法。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨特之處
- 本課題采用現(xiàn)代先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將PiggyBac轉(zhuǎn)座子元件改造成適合哺乳類動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因載體，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因在哺乳動物體內(nèi)的高效表達(dá)，為進(jìn)一步進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 構(gòu)建成的轉(zhuǎn)座子基因載體能夠有效地將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞并有效表達(dá)。 具體應(yīng)用包括： 可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及人類基因治療相關(guān)研究中； 可作為基因功能鑒定的有效工具，探尋人類功能基因的確證，發(fā)現(xiàn)人類疾病如腫瘤、癌癥等相關(guān)重要功能基因。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本實驗應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)和分子克隆技術(shù)方法，將PiggyBac轉(zhuǎn)座子元件改造成適合哺乳類動物細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)基因載體。該基因載體以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因為報告基因，以新霉素抗性（Nero）基因為哺乳動物細(xì)胞抗性篩選基因。在實驗起始階段，設(shè)計引物人工合成引物序列，利用引物經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）擴(kuò)增獲得GFP基因序列。將該基因轉(zhuǎn)入克隆質(zhì)粒載體pIR-CMV。轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，進(jìn)行擴(kuò)增。然后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，獲得pIR-CMV-GFP載體，與含有PiggyBac編碼序列的載體pDNA-piggyBac，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗。實驗結(jié)果表明，以PiggyBac介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)能夠高效的表達(dá)。由此可見，經(jīng)改造的PiggyBac轉(zhuǎn)座子元件可以成為哺乳類動物細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)基因載體。這就為進(jìn)一步進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 查鑫華等同學(xué)作品《PiggyBac轉(zhuǎn)座子在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因研究》，實驗設(shè)計合理，報告內(nèi)容屬實，具有較高的創(chuàng)新價值。
參考文獻(xiàn)
- （1）鄧海瑩, 張磊等，piggyBac轉(zhuǎn)座子生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物研究進(jìn)展， 中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會第十四屆學(xué)術(shù)研討會論文集，2008； （2）張博, 陳兵等， 昆蟲的轉(zhuǎn)座子及其功能， 昆蟲知識, 2009 , 46 (2):187～195； （3）唐麗莉,陳斌等,piggyBac轉(zhuǎn)座子及其轉(zhuǎn)基因昆蟲的應(yīng)用，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010年第06期； （4）顏海燕,鐘伯雄等，昆蟲轉(zhuǎn)基因載體--piggyBac轉(zhuǎn)座子， 蠶業(yè)科學(xué)， 2000年 第Z1期 （5）Collier,L，S．，Carlson，C．M．，Rwimohm，S．，Dupuy,AJ．，and Larguespada,D．A．(2005)．Cancer gene discovery in solid tumonrs using transposon-based somatic mutagencsis in the mouse．Nature 436,272-276； （6）Davie，S．A．，Maglione，J．E．，Manner,C．k，Young,D，，Cardiif,ILD．，Macleod,C?L end Ellies，L．G (2007)．Effects of FvB，NJ and C57BI／6J strain backgrounds on mammary mmor phenotype in inducible nitric oxide synthase deficient mice．Transgenic Res 16,193-201．
同類課題研究水平概述
- 目前現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)主要應(yīng)用經(jīng)典的原核顯微注射法和核移植法，該技術(shù)存在缺陷是轉(zhuǎn)基因元件在動物基因組整合率很低，整個實驗操作復(fù)雜，所需成本很高。隨后開發(fā)的病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以獲得高效率的轉(zhuǎn)基因，但是問題是病毒對宿主細(xì)胞造成潛在的危險，即便是復(fù)制缺陷型的重組病毒，同樣存在病毒的生物安全性問題，因此，急需探索新的用于動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備的元件。 轉(zhuǎn)座子是基因組中一段可移動的DNA序列，可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置（Barbara Mclintock）。這一元件不僅可用于分析生物遺傳進(jìn)化上分子作用引起的一些現(xiàn)象，而且為基因工程和分子生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具。在昆蟲、家蠶以及模式生物果蠅中，研究者已經(jīng)成功應(yīng)用轉(zhuǎn)座子元件，如P因子，獲得了轉(zhuǎn)基因果蠅新品系，但是多數(shù)類似的轉(zhuǎn)座子元件不能獨立應(yīng)用于哺乳類動物，直到最近幾年，國際上研究者逐漸開發(fā)出了幾種，其中Sleeping Beauty（SB）研究最多，但是SB載體系統(tǒng)存在諸如轉(zhuǎn)座效率低和攜帶目標(biāo)基因容量小等很多問題，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。 因此，本項目旨在改造來自于昆蟲類的轉(zhuǎn)座子PiggyBac，經(jīng)過啟動子篩選和序列修飾，以其獲得一種高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)，從而為哺乳類動物轉(zhuǎn)基因制備和人類基因治療載體的研制奠定基礎(chǔ)。
