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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 小鼠N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶IVa基因RNA干擾載體的構(gòu)建
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本作品利用載體介導(dǎo)RNAi，實(shí)現(xiàn)RNA干擾在哺乳動物體內(nèi)長期穩(wěn)定發(fā)揮作用。同時選取的靶基因Mgat4a與腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制目前研究較少，具有創(chuàng)新性。
- 詳細(xì)介紹：
- 本研究采用pLL3.7干擾質(zhì)粒表達(dá)載體, 插入oligo DNA后能在靶細(xì)胞中持續(xù)轉(zhuǎn)錄生成shRNA, 從而生成具有干擾作用的siRNA。同時該質(zhì)粒含有GFP基因, 用于檢測表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染情況。我們利用公用網(wǎng)站按照RNAi 序列設(shè)計(jì)原則, 設(shè)計(jì)合成3對含干擾序列的oligo DNA片段, 克隆入干擾質(zhì)粒表達(dá)載體pLL3.7, 構(gòu)建了能表達(dá)siRNA 的重組干擾質(zhì)粒。通過酶切和測序鑒定, 證實(shí)成功構(gòu)建pLL3.7/shRNA1、2、3表達(dá)質(zhì)粒。并成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后, 檢測到GFP的陽性表達(dá)。為后續(xù)研究GnT-IVa基因在糖蛋白N-聚糖分支合成中的作用，及肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：針對小鼠N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶IVa的基因構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體，為研究其功能提供有力工具。 基本思路：針對小鼠N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶IVa的基因設(shè)計(jì)多對shRAN序列，利用分子克隆技術(shù)，插入表達(dá)載體pLL3.7，鑒定正確的重組載體后，檢測載體介導(dǎo)的下調(diào)靶基因的功能，可以為后續(xù)研究GnT-IVa基因在糖蛋白N-聚糖分支合成中的作用，及肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（GnT）是催化N聚糖鏈分支合成的關(guān)鍵酶，GnTs成員之一的GnT-IVa與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系不清楚，研究較少。 2、載體介導(dǎo)的RNAi能夠?qū)崿F(xiàn)針對靶基因的穩(wěn)定下調(diào)，為研究靶基因的功能提供有力支持。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 1、RNA干擾載體能夠使載體攜帶的shRNA片段整合到靶細(xì)胞的基因組中, 持續(xù)地發(fā)揮對目的基因的沉默效應(yīng), 使長期穩(wěn)定下調(diào)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的目的基因成為可能。 2、本研究構(gòu)建了針對GnT-IVa 基因的RNAi表達(dá)載體，為研究GnT-IVa在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 為了構(gòu)建針對小鼠N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（GnT）IVa基因的RNA干擾( RNAi)表達(dá)載體。本研究針對GnT-IVa基因序列設(shè)計(jì)合成 3對shRNA序列，經(jīng)退火成雙鏈后，與酶切后的線性表達(dá)載體pLL3.7連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)酶切和測序鑒定構(gòu)建的干擾表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡檢測干擾表達(dá)載體中綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)。經(jīng)酶切及測序證實(shí)shRNA序列插入到干擾表達(dá)質(zhì)粒中，并檢測到干擾表達(dá)載體中GFP的表達(dá)。說明成功構(gòu)建了針對小鼠N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（GnT）IVa基因的干擾表達(dá)載體。
獲獎情況
- 2011年4月 該作品獲得大連醫(yī)科大學(xué)第五屆大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽 特等獎
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- RNA干擾（RANi） Fire A,et.al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature,1998,391(6669)
同類課題研究水平概述
- 1、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（GnT）是催化N聚糖鏈分支合成的關(guān)鍵酶，研究發(fā)現(xiàn)GnT-V的表達(dá)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，而GnT-III的表達(dá)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。其GnTs成員之一的GnT-IVa催化β1，4分支三天線N-聚糖的合成，其與糖尿病的關(guān)系近幾年有所報(bào)道，但其與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系不清楚。目前國內(nèi)外研究較少。 2、RNA干擾現(xiàn)象是一種特異性轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象，因其具有快速、有效、易操作、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn), 現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于基因功能分析、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基因治療的研究，但是目前國內(nèi)多用采用直接化學(xué)合成siRNA片段的方法直接將干擾片段轉(zhuǎn)染進(jìn)入目的細(xì)胞，因此RNAi 片段轉(zhuǎn)染進(jìn)入目的細(xì)胞以及siRNA(Dicer酶切或化學(xué)合成)作用的短暫性，在目前的哺乳動物RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用中受到限制。載體介導(dǎo)的RNAi 系統(tǒng)則可通過RNA 多聚酶Ⅲ啟動轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA 實(shí)現(xiàn)RNAi。此方法國內(nèi)應(yīng)用較少，且尚待改進(jìn)和提高。
