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基本信息

項(xiàng)目名稱：
腈水解酶序列結(jié)構(gòu)功能分析與酶的應(yīng)用
小類(lèi)：
生命科學(xué)
簡(jiǎn)介：
本作品對(duì)腈水解酶基因進(jìn)行篩選，克隆/合成了一系列腈水解酶，并使它們?cè)诖竽c桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到了一定活力的腈水解酶。為提高腈水解酶的活力和穩(wěn)定性，本研究采用同源建模、分子對(duì)接手段建立判斷腈水解酶類(lèi)型的方法，在基因水平上對(duì)腈水解酶進(jìn)行改造，最終分別得到了應(yīng)用于制備R-扁桃酸（醫(yī)藥中間體）及亞氨基二乙酸（農(nóng)藥中間體）的2個(gè)腈水解酶，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
詳細(xì)介紹：
本研究對(duì)腈水解酶基因進(jìn)行篩選，克隆/合成了一系列腈水解酶基因，并使它們?cè)诖竽c桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到了一定活力的腈水解酶。為提高腈水解酶的活力，采用同源建模、分子對(duì)接手段建立判斷腈水解酶類(lèi)型的方法，在基因水平上對(duì)腈水解酶進(jìn)行改造，最終分別得到了應(yīng)用于制備R-扁桃酸（醫(yī)藥中間體）及亞氨基二乙酸（農(nóng)藥中間體）的2個(gè)腈水解酶，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。 立體選擇性腈水解酶生物催化合成醫(yī)藥中間體—R-扁桃酸的研究：設(shè)計(jì)特異引物，以糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis ZJUTB10)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測(cè)序分析得知該腈水解酶基因讀碼框全長(zhǎng)1068 bp, 與來(lái)自Pseudomonas putida strain MTCC 5110 的腈水解酶cDNA結(jié)構(gòu)基因同源性為78 %，進(jìn)一步分析了氨基酸序列的保守位點(diǎn)并模擬了蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)。構(gòu)建得到重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28b-NIT，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳檢測(cè)出有明顯的目的蛋白（約40 KDa）表達(dá)。對(duì)該腈水解酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，其最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH為7-8，Ca2+、Mg2+對(duì)酶促反應(yīng)有促進(jìn)作用，而Ag+和Hg2+對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用。最終，在20 mM底物濃度下，該腈水解酶對(duì)扁桃腈轉(zhuǎn)化率>90%，R-扁桃酸e.e.>99%，對(duì)底物扁桃腈，該酶的Km值為4.74 mM，Vmax值為 15.85 μmol min–1 mg–1 protein。 腈水解酶生物催化制備農(nóng)藥中間體—亞氨基二乙酸的研究：利用PCR assembly合成了不同來(lái)源的9條腈水解酶序列，采用同源建模、分子對(duì)接手段建立判斷腈水解酶類(lèi)型的方法。通過(guò)對(duì)不同類(lèi)型的腈水解酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，選擇了合適的突變位點(diǎn)，在基因水平上對(duì)其中的一個(gè)腈水解酶進(jìn)行分子改造，最終，在1 %底物（亞氨基二乙腈）濃度下，該亞氨基二乙腈水解酶對(duì)亞氨基二乙腈轉(zhuǎn)化率由最初的60 %提高到95 %。 綜上，這兩個(gè)腈水解酶作為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)秀生物催化劑，將在精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中有重要的理論研究意義和廣闊的應(yīng)用前景。

作品專業(yè)信息

設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)

創(chuàng)新點(diǎn)： ①開(kāi)展了腈水解酶結(jié)構(gòu)與功能之間的研究，建立一種基于計(jì)算機(jī)分析的快速判斷腈水解酶類(lèi)型的方法（國(guó)內(nèi)外論文對(duì)腈水解酶的研究大多是從它的應(yīng)用角度展開(kāi)的）； ②通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分析各個(gè)種類(lèi)的腈水解酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果，選擇空間上相對(duì)集中且適當(dāng)遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的氨基酸殘基作為突變位點(diǎn)進(jìn)行突變，大幅提高了酶的活力（此項(xiàng)針對(duì)腈水解酶的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道）； ③利用生物法生產(chǎn)制備除草劑草甘膦的關(guān)鍵中間體亞氨基二乙酸（國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道）。 技術(shù)關(guān)鍵： ①設(shè)計(jì)同源引物，克隆得到腈水解酶基因是項(xiàng)目進(jìn)行的關(guān)鍵； ②在腈水解酶C端或N端設(shè)計(jì)親和標(biāo)簽是利用Ni-NTA親和柱分離純化重組腈水解酶，獲得電泳純重組酶的關(guān)鍵； ③利用生物信息學(xué)，分子動(dòng)力學(xué)及計(jì)算機(jī)分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)和模擬底物與腈水解酶結(jié)合方式和酶催化機(jī)理是建立一種判斷腈水解酶類(lèi)型方法的關(guān)鍵； ④對(duì)腈水解酶的結(jié)構(gòu)分析、選擇有效的突變位點(diǎn)，是腈水解酶分子改造成功的關(guān)鍵。 主要技術(shù)指標(biāo)： ①成功建立分析腈水解酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的模型； ②構(gòu)建得到若干株基因工程菌，能應(yīng)用于醫(yī)藥中間體的制備與農(nóng)藥中間體的生產(chǎn)； ③建立腈水解酶基因的快速篩選模型； ④分子改造后的突變菌株基本能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。

科學(xué)性、先進(jìn)性

本作品利用分子生物學(xué)技術(shù)最終得到了2株含腈水解酶基因工程菌，其中一株菌產(chǎn)腈水解酶催化反應(yīng)，產(chǎn)物R-扁桃酸的得率大于98%，e.e.值超過(guò)99%，達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平；另一株菌能利用腈水解酶生產(chǎn)制備草甘膦的關(guān)鍵中間體亞氨基二乙酸，新開(kāi)發(fā)的路線能耗低、環(huán)境友好，國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。 本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分析各個(gè)種類(lèi)的腈水解酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果，選擇空間上相對(duì)集中且適當(dāng)遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的氨基酸殘基作為突變位點(diǎn)進(jìn)行突變，提高了酶的活力。 本項(xiàng)目開(kāi)展了腈水解酶結(jié)構(gòu)與功能之間的研究，建立了一種基于計(jì)算機(jī)分析的快速判斷腈水解酶類(lèi)型的方法，而國(guó)內(nèi)外論文對(duì)腈水解酶的研究大多是從它的應(yīng)用角度展開(kāi)的。

獲獎(jiǎng)情況及鑒定結(jié)果

A novel synthesis of iminodiacetic acid: Biocatalysis by whole Alcaligenes faecalis ZJB-09133 cells from iminodiacetonitrile,Biotechnology Progress,2011 Gene cloning,expression and characterization of a nitrilase from soil bacterium Alcaligenes faecails ZJUTB10,in press Characterization of an enantioselective amidase from Delftia tsuruhatensis CCTCC M 205114 and its application in asymmetric hydrolysis of (R)-2,2-dimethylcyclopropane carboxamide,Journal of Biotechnology,in press 改進(jìn)酶穩(wěn)定性的定向進(jìn)化技術(shù),生物技術(shù)通報(bào),2010(R)-鄰氯扁桃酸的制備技術(shù)進(jìn)展,化工進(jìn)展,2011氯吡格雷生產(chǎn)技術(shù)的研究進(jìn)展,現(xiàn)代化工,出版中 誘變選育產(chǎn)腈水解酶高產(chǎn)菌株,食品與發(fā)酵工業(yè),出版中 生物催化鄰氯扁桃腈不對(duì)稱合成(R)-鄰氯扁桃酸,第六屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì).2010.長(zhǎng)沙 糞產(chǎn)堿桿菌腈水解酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究,第三屆長(zhǎng)三角生物技術(shù)研究生學(xué)術(shù)論壇.2010.上海.優(yōu)秀論文獎(jiǎng) 催化水解亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸菌株的誘變育種.第三屆長(zhǎng)三角生物技術(shù)研究生學(xué)術(shù)論壇.2010.上海 浙江工業(yè)大學(xué)“運(yùn)河杯”特等獎(jiǎng)

作品所處階段

生產(chǎn)階段

技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式

專利

作品可展示的形式

現(xiàn)場(chǎng)演示

使用說(shuō)明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說(shuō)明,市場(chǎng)分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測(cè)

一、建立了高效R-扁桃酸生物合成工藝，實(shí)現(xiàn)工業(yè)生物技術(shù)提升傳統(tǒng)化學(xué)工業(yè)，技術(shù)成果轉(zhuǎn)讓主要面向制藥和化工企業(yè)；目標(biāo)產(chǎn)物R-扁桃酸e.e.值超過(guò)99%，滿足市場(chǎng)對(duì)高純度R-扁桃酸的生產(chǎn)需求；并建立了綠色轉(zhuǎn)化過(guò)程和提取過(guò)程。 推廣前景：有效地提升我國(guó)的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，組成有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)業(yè)鏈。有利于我國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步提升，并可創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟(jì)效益。本研究對(duì)發(fā)展我國(guó)的生物醫(yī)藥行業(yè)有重要的作用，因此，本項(xiàng)目具有非常好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，已在浙江來(lái)益生物有限公司建成年產(chǎn)100噸的生產(chǎn)線。 二、亞氨基二乙酸作為一種合成除草劑草甘膦的重要農(nóng)藥中間體。預(yù)計(jì)到2015年，草甘膦全球的需求量將超過(guò)100萬(wàn)噸。目前，草甘膦占全球除草劑總量的1/3，市場(chǎng)銷(xiāo)售額約為150億美元。目前的化學(xué)法合成成本高、污染嚴(yán)重。 推廣前景：目前我們正在進(jìn)行中試實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，收率高，無(wú)環(huán)境污染，已為日后的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，則需要進(jìn)行更加深入的研究。

同類(lèi)課題研究水平概述

腈水解酶能夠催化腈水解生成相應(yīng)的羧酸和氨。根據(jù)腈水解酶的底物特異性，可分三種：芳香族、脂肪族和芳基乙腈類(lèi)腈水解酶。 目前，大部分腈水解酶已被詳細(xì)表征，相當(dāng)部分腈水解酶亞基的分子量及天然結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的腈水解酶的亞基分子量和天然構(gòu)象不盡相同，許多腈水解酶包含相同的多肽，分子量為40kDa左右；不同酶含有的亞基數(shù)量也不同，一般亞基數(shù)為2-26。最近，Brenner等人根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及酶學(xué)數(shù)據(jù)，核對(duì)了176個(gè)酶的序列，將整個(gè)腈水解酶家族進(jìn)行了重新定義。根據(jù)蠕蟲(chóng)的NitFhit晶體結(jié)構(gòu)分析，腈水解酶活性部位含有Glu-Lys-Cys三個(gè)殘基，其中半胱氨酸上的殘基在催化反應(yīng)中的作用十分關(guān)鍵。腈水解酶在有機(jī)合成重要中間體——有機(jī)羧酸的制備中有十分重要的應(yīng)用。現(xiàn)有研究表明：腈水解酶生物催化法制備有機(jī)酸具有高效性、高選擇性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，有著化學(xué)方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性。 利用腈水解酶作為生物催化劑制備有機(jī)羧酸已被廣泛開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。瑞士Lonza公司已采用腈水解酶催化方法工業(yè)生產(chǎn)B族維生素?zé)熕岷蜔燉０?。日本日東公司利用生產(chǎn)丙烯酰胺的第三代菌種R. rhodochrous J1的固定化細(xì)胞進(jìn)行催化生產(chǎn)，通過(guò)改變培養(yǎng)條件分別誘導(dǎo)腈水解酶和腈水合酶可以得到單一產(chǎn)物，通過(guò)將產(chǎn)物不斷分離的方法可以減輕產(chǎn)物對(duì)酶的抑制，從而提高生產(chǎn)效率。另外，腈水解酶具有良好的立體選擇性，可以催化合成各種光學(xué)純的羧酸。其中，最成功的例子是德國(guó)BASF公司利用糞產(chǎn)堿菌A. faecalis ATCC 8750腈水解酶不對(duì)稱合成(R)-(-)-扁桃酸，它是半合成頭孢菌素和青霉素的中間體，手性拆分試劑，抗腫瘤藥物和抗肥胖藥的重要手性合成子。未反應(yīng)的S-扁桃腈由于化學(xué)平衡而參與外消旋化，該反應(yīng)的收率達(dá)91%，產(chǎn)物的光學(xué)純度為100%。目前該項(xiàng)目已經(jīng)以年產(chǎn)幾噸的規(guī)模開(kāi)始試生產(chǎn)。Lonza公司還篩選了新的腈水解酶菌種，用于5-羥基吡嗪-2-甲酸及5-羥基吡啶-2-甲酸的生產(chǎn)。還有報(bào)道利用菌株腈水解酶和煙酸胺脫氫酶的共同作用，分別從2-氰基吡嗪和2-氰基吡啶出發(fā)，合成藥物中間體5-羥基吡嗪-2-甲酸及5-羥基吡啶-2-甲酸，轉(zhuǎn)化率接近100%。
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