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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- PCR-SSP法檢測(cè)29種HLA-B27亞型
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本次檢測(cè)強(qiáng)制性脊柱炎(ＡＳ)方法是在新的高分辨ＰＣＲ－ＳＳＰ法基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。與以往檢測(cè)相比，此法充分考慮所設(shè)計(jì)引物的特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此法能夠檢測(cè)出以往方法不能達(dá)到的２９條基因亞型。該法根據(jù)內(nèi)對(duì)照及有無(wú)特異性區(qū)帶使判定結(jié)果一目了然，可以快速準(zhǔn)確的對(duì)ＨＬＡ－Ｂ２７的相關(guān)亞型進(jìn)行檢測(cè)，從亞型水平探究AS的發(fā)病機(jī)制，提供了臨床上早期診斷AS的新方法。
- 詳細(xì)介紹：
- 本次檢測(cè)強(qiáng)制性脊柱炎(ＡＳ)方法是在新的高分辨ＰＣＲ－ＳＳＰ法基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。與以往只能檢測(cè)７～２３條亞型的不足而造成的缺乏性和完整性不足相比，此法充分考慮所設(shè)計(jì)引物的特異性，并對(duì)多數(shù)已有的ＰＣＲ檢測(cè)條件做出相應(yīng)調(diào)整，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此法能夠檢測(cè)出以往方法不能達(dá)到的２９條基因亞型。該法根據(jù)內(nèi)對(duì)照及有無(wú)特異性區(qū)帶使判定結(jié)果一目了然，可以快速準(zhǔn)確的對(duì)ＨＬＡ－Ｂ２７的相關(guān)亞型進(jìn)行檢測(cè)，從亞型水平探究AS的發(fā)病機(jī)制，提供了臨床上早期診斷AS的新方法，為進(jìn)一步研究ＨＬＡ－Ｂ２７與疾病的關(guān)聯(lián)，深入探討ＡＳ的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)檢測(cè)手段相比，本檢測(cè)手段可以較全面檢測(cè)盡可能多分子亞型，對(duì)器材要求低，速度快，在基因水平診斷上,具有良好的預(yù)見性,非常適于臨床應(yīng)用。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的:建立一種新的聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR-SSP）高分辨技術(shù)檢測(cè)HLA-B27基因亞型，為HLA-B27基因多態(tài)性研究奠定實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。 基本思路: 設(shè)計(jì)合成HLA-B27亞型特異性引物35條（配對(duì)組成上下游引物組合29對(duì)）和內(nèi)對(duì)照引物一對(duì)，建立PCR-SSP方法，用于B27亞型分型。檢測(cè)標(biāo)本HLA-B27陽(yáng)性研究對(duì)象外周血基因組DNA。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 科學(xué)性：由于HLA-B27基因在不同人群分布有明顯的差異且不同的抗原也存在差別，從分子水平研究HLA-B27亞型與AS的相關(guān)性更準(zhǔn)確。 先進(jìn)性：該法具有高度特異性、敏感性、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便快速、對(duì)樣本要求低和無(wú)需昂貴設(shè)備等特點(diǎn)，內(nèi)對(duì)照的引入更保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。 獨(dú)特性：高分辨HLA-B27亞型檢測(cè)可分析多達(dá)29種亞型；根據(jù)內(nèi)對(duì)照及有無(wú)特異性區(qū)帶使判定結(jié)果一目了然、快速準(zhǔn)確。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- PCR-SSP法從基因的多態(tài)性出發(fā)，可以檢測(cè)HLA-B27的32種亞基中的29種，范圍更廣，滿足當(dāng)前醫(yī)學(xué)檢測(cè)需要。與血清法、流式細(xì)胞術(shù)等相比具有準(zhǔn)確性高、靈敏度強(qiáng)、耗材少、用時(shí)少、成本低等優(yōu)越性，更適用于醫(yī)學(xué)類尤其是醫(yī)院檢測(cè)。且在臨床上對(duì)于AS的早期診斷和治療具有重要意義，適于患者早期確診，區(qū)分類風(fēng)濕類疾病與AS患者，避免誤診。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明AS與HLA-B27的相關(guān)性，具有醫(yī)學(xué)意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的 建立一種新的聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR-SSP）高分辨技術(shù)檢測(cè)29種HLA-B27基因亞型。方法 設(shè)計(jì)合成HLA-B27亞型特異性引物35條（配對(duì)組成上下游引物組合29對(duì)）和內(nèi)對(duì)照引物一對(duì)，建立PCR-SSP方法，用于B27亞型分型。檢測(cè)標(biāo)本為117例HLA-B27陽(yáng)性研究對(duì)象（男79名，女38名）外周血基因組DNA 。 結(jié)果 117例標(biāo)本的PCR-SSP擴(kuò)增均獲得成功，成功的構(gòu)建了PCR-SSP檢測(cè)反應(yīng)體系。共檢測(cè)出6種亞型：B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706及B*2713。六種亞型的構(gòu)成比分別為：0.85%、6.84%、64.10%、25.64%、1.71%、0.85%，其中B*2704和B*2705為中國(guó)漢族人群中主要亞型。 結(jié)論 應(yīng)用該新型PCR-SSP高分辨技術(shù)進(jìn)行HLA-B27基因亞型檢測(cè)能檢測(cè)出較多HLA-B27亞型，且該法進(jìn)行B27亞型分型分辨度高、特異性強(qiáng)，成本較低，適合于臨床應(yīng)用。
獲獎(jiǎng)情況
- 于《分子診斷與治療雜志》（ISSN 1674-6929；CN 44-1656/R）2011年5月第3期刊發(fā)
鑒定結(jié)果
- 117例標(biāo)本擴(kuò)增均獲得成功，構(gòu)建了PCR-SSP檢測(cè)反應(yīng)體系。 共檢測(cè)出6種亞型：B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706及B*2713。
參考文獻(xiàn)
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同類課題研究水平概述
- 目前檢測(cè)HLA-B27基因亞型手段中，常用的有經(jīng)典的血清學(xué)分型技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)及磁珠酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)法和基因分型技術(shù)，不常用的有玫瑰花法、ELISA法等。 1,微量淋巴細(xì)胞毒法 HLA- B27抗原與其特異性抗體結(jié)合.優(yōu)點(diǎn): 操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率尚可且,成本較低;缺點(diǎn):單價(jià)血清獲取困難，受細(xì)胞純度、補(bǔ)體差異、操作繁瑣，單抗效價(jià)及HLA高度多態(tài)性的影響，易出現(xiàn)錯(cuò)判漏判. 2, 流式細(xì)胞技術(shù) 流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合單克隆抗體，可以迅速區(qū)分出淋巴細(xì)胞亞群，并檢測(cè)出CD+3細(xì)胞中HLA-B27抗原陽(yáng)性的細(xì)胞百分比.優(yōu)點(diǎn): 可以迅速區(qū)分出淋巴細(xì)胞亞群,結(jié)果精確;缺點(diǎn):HLA-B27單克隆抗體和儀器只有較大醫(yī)院才擁有。 3, 磁珠酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)法 結(jié)合磁珠分離和酶聯(lián)免疫分析,分離全血中HLA-B27抗原及白細(xì)胞及染色。優(yōu)點(diǎn):特異性強(qiáng),敏感度高,重復(fù)性好。缺點(diǎn):操作步驟復(fù)雜。 4, HLA基因分型技術(shù) 目前檢測(cè)HLA-B27亞型的基因分型技術(shù)主要有聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR-SSP），DNA 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析, PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性及PCR-DNA測(cè)序等方法。最為常用的為PCR-SSP，其優(yōu)點(diǎn)為: 準(zhǔn)確性高、靈敏度強(qiáng)、耗材少、用時(shí)少、成本低等優(yōu)越性，更加適用于醫(yī)學(xué)類尤其是醫(yī)院檢測(cè). 缺點(diǎn):易受感染出現(xiàn)假陰性和標(biāo)本的DNA交叉污染. 文獻(xiàn)資料顯示，絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用檢測(cè)HLA-B27方法為微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測(cè)法. HLA基因分型技術(shù)較血清學(xué)分型有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)只需全血0.5 ml即可獲得足夠數(shù)量的DNA，并可重復(fù)數(shù)十次試驗(yàn)；(2)可保存于無(wú)水乙醇中，視其純度存放多年；(3)由于加入了429 bpHGH內(nèi)對(duì)照引物，使實(shí)驗(yàn)方法更加可靠，避免出現(xiàn)漏檢和假陽(yáng)性反應(yīng)；(4)實(shí)驗(yàn)快捷簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好。微量的DNA就可以擴(kuò)增達(dá)到106～107倍的量，達(dá)到常規(guī)方法檢測(cè)所需的濃度. 由于受HLA基因分型技術(shù)的限制，以往的研究中往往只能分析少量HLA-B27亞型，從亞型水平探討AS的發(fā)病機(jī)制的研究結(jié)果缺乏精確性與完整性。因此創(chuàng)建的一種新的PCR-SSP高分辨技術(shù)，以檢測(cè)到更多種HLA-B27基因亞型，為進(jìn)一步研究HLA-B27基因亞型與AS的關(guān)系打下實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)，這是國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。
