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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 瓊膠酶海洋菌發(fā)酵條件優(yōu)化、酶促動(dòng)力學(xué)及降解產(chǎn)物開發(fā)研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 我們利用海洋的優(yōu)勢，將篩選獲得的瓊膠酶生產(chǎn)菌與實(shí)驗(yàn)室菌株進(jìn)行比較研究后，最后選擇高活性產(chǎn)酶菌株白色噬瓊膠菌NBRC102603作為研究對(duì)象。主要進(jìn)行的工作包括產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，酶的分離純化，酶促動(dòng)力學(xué)研究，酶的固定化以及固定化酶解產(chǎn)物瓊寡糖的分離純化及其抗氧化性研究。通過這一系統(tǒng)研究，為瓊膠酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)，也為開發(fā)瓊膠保健食品, 拓寬瓊膠酶的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
- 詳細(xì)介紹：
- 海洋作為生命之源，孕育著無限豐富的生物資源，海洋藥物研究以及功能性食品的開發(fā)越來越受到人們的重視。瓊脂是目前世界上應(yīng)用最廣泛的的海藻膠之一。天然瓊脂主要存在于某些海藻的細(xì)胞壁中，瓊膠酶在海藻的單細(xì)胞分離、酶解破壁制備原生質(zhì)體等過程具有重要的使用價(jià)值，是一種海藻遺傳工程的工具酶。同時(shí)，瓊膠酶在分子生物學(xué)方面、海藻多糖的結(jié)構(gòu)研究、制備瓊脂低聚糖等方面有巨大應(yīng)用價(jià)值。由于瓊脂低聚糖具有多種特殊功能，例如作為天然的防腐劑、淀粉老化抑制劑、功能性食品基料、抗氧化劑、在藥物方面抑制癌細(xì)胞的發(fā)生等等，而備受關(guān)注。瓊膠酶降解過程不需要加入大量反應(yīng)試劑，且具有得率高、污染小和產(chǎn)物的安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是降解瓊脂糖最有潛力的方法。 本文首先對(duì)瓊膠酶菌株NBRC102603，發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，提高了產(chǎn)酶能力。進(jìn)一步對(duì)該菌株的發(fā)酵液進(jìn)行了酶的分離純化，制得了兩種高活性的瓊膠酶，進(jìn)行了酶的性質(zhì)分析，為高活性瓊膠酶的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了一定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 其次，瓊膠酶的固定化研究在國內(nèi)外尚未有相關(guān)報(bào)道，我們?cè)谑褂脷ぞ厶呛秃Ｔ逅徕c進(jìn)行比較研究后，確定使用殼聚糖對(duì)瓊膠酶進(jìn)行固定化，正交試驗(yàn)法選出最佳固定化工藝。同時(shí)探討了其最適反應(yīng)溫度、pH值等，使固定化酶具有一定的工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。 最后，我們將固定化酶進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用制備瓊脂低聚糖，體外測定其抗氧化性后，用酒精作為誘導(dǎo)劑,建立小鼠急性肝氧化損傷模型,進(jìn)一步在體內(nèi)觀察瓊寡糖的抗氧化作用。為開發(fā)瓊膠保健食品, 拓寬瓊膠的應(yīng)用范圍進(jìn)一步提供了理論依據(jù)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 首先，對(duì)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化，提高其產(chǎn)酶能力。酶分離純化后，得兩種高活性酶，為瓊膠酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。 其次，瓊膠酶的固定化研究在國內(nèi)外尚未有相關(guān)報(bào)道，酶固定化后，研究其酶學(xué)性質(zhì)，使固定化酶具有一定的工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。 最后，固定化酶制備瓊寡糖，體外測定抗氧化性后，建立小鼠肝氧化損傷模型,進(jìn)一步觀察瓊寡糖的抗氧化作用。為開發(fā)瓊膠保健食品, 拓寬瓊膠酶的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1、從海洋菌中提取瓊膠酶并將其轉(zhuǎn)化到實(shí)際應(yīng)用，該法環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、具有可持續(xù)開發(fā)等優(yōu)點(diǎn)，符合山東省藍(lán)色海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展計(jì)劃，體現(xiàn)沿海特色和較高的創(chuàng)新性。 2、近年來有關(guān)瓊膠酶的研究較廣泛，但較局限于菌株選育、產(chǎn)酶條件優(yōu)化，酶的固定化在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。通過該研究，為瓊膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新思路。 3、海洋是生命之源，孕育著豐富的資源，我們利用海洋的優(yōu)勢，將獲得的菌種進(jìn)行瓊膠酶提取和活性研究。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化后，酶活力顯著提高，為酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。 固定化酶的熱穩(wěn)定性，耐堿性，操作穩(wěn)定性均提高，為酶的實(shí)際應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。 物質(zhì)Ⅱ?qū)?OH以及DPPH具有較好的清除能力，同時(shí)能夠提高GSH-Px、SOD活性, 增加GSH含量,降低MDA含量。拓寬了瓊膠酶的應(yīng)用范圍。 我們通過對(duì)瓊膠酶的基礎(chǔ)性研究，大力開發(fā)瓊脂降解產(chǎn)物，力求使其成為一個(gè)新的產(chǎn)業(yè)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本文對(duì)菌株NBRC102603發(fā)酵條件優(yōu)化，最佳發(fā)酵條件為：蛋白胨濃度5.0g/L、酵母膏濃度1.25g/L、瓊膠濃度4.0g/L、裝瓶量100ml，28℃條件下發(fā)酵48 h后酶活力最高，為58.94U/mL，比未優(yōu)化前提高了2.08倍。純化得2種酶，瓊膠酶A純化倍數(shù)為17.29倍,酶比活力為870.51U/mg; 瓊膠酶B純化倍數(shù)為16.65倍,酶比活力為838.39 U/mg。經(jīng)SDS-PAGE檢測,兩者均顯示單一條帶,其相對(duì)大小分別為83.6KDa、36.8KDa。 殼聚糖對(duì)瓊膠酶進(jìn)行固定化，對(duì)固定化酶進(jìn)行研究，結(jié)果表明:在戊二醛濃度2.5%，交聯(lián)時(shí)間4h，固定3h，固定化效果最好；與游離酶相比較，固定化酶的最適反應(yīng)溫度及最適pH值均升高，同時(shí)固定化酶熱穩(wěn)定性、耐堿性、操作穩(wěn)定性均提高。 利用固定化酶制備瓊寡糖，對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性研究。5種酶解產(chǎn)物中，物質(zhì)Ⅱ?qū)?OH以及DPPH具有較好的清除能力。同時(shí)觀察其對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠氧化損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明：瓊寡糖能夠提高GSH-Px、SOD活性, 增加GSH含量,降低MDA含量。說明瓊寡糖具有抗氧化活性。
獲獎(jiǎng)情況
- 1.作品《產(chǎn)瓊膠酶菌株NBRC102603發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的分離純化》，發(fā)表于食品與發(fā)酵工業(yè)（全國中文核心期刊）第四期 2.作品《瓊膠酶酶學(xué)性質(zhì)及固定化方法研究》，發(fā)表于基因組與應(yīng)用生物學(xué)（全國中文核心期刊）第六期 3.作品《固定化瓊膠酶降解產(chǎn)物抗氧化活性研究》，中國食品學(xué)報(bào)（全國中文核心期刊）專家外審中
鑒定結(jié)果
- 上述情況屬實(shí)。
參考文獻(xiàn)
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同類課題研究水平概述
- 瓊膠酶是一種海藻工具酶,其瓊膠水解產(chǎn)物瓊膠寡糖具有多種生理活性,在醫(yī)藥上具有重要的應(yīng)用潛力;同時(shí),瓊膠酶在海水養(yǎng)殖和現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中也有重要的應(yīng)用價(jià)值。國外對(duì)于瓊膠酶的研究近幾十年來多有報(bào)道,分離出一些瓊膠酶高產(chǎn)菌株。1902年Groleau第1次從海水中分離到能分解瓊膠的細(xì)菌－瓊膠假單胞菌。從那以后人們從海水系統(tǒng)已經(jīng)分離得到的瓊膠分解菌包括Pseudomonas(假單胞菌屬)、Pseudoalteromonsa(假別單胞菌屬)、Alteromonas(別單胞菌屬)、Microscilla、Vibrio(弧菌屬)、Cytophaga(噬細(xì)胞菌屬)等。除微生物，瓊膠酶還可以從一些以海藻為食的海洋動(dòng)物的腸道中分離得到，研究者采用(NH4)2S04分段鹽析和葡聚糖柱層析存化技術(shù)，從九孔鮑內(nèi)臟器官中提取存化了瓊膠酶。除此以外，一些非海洋產(chǎn)生瓊膠酶的菌株被發(fā)現(xiàn)，包括從淡水中分離到的Cytophaga sp.(噬細(xì)胞菌)，從土壤中分離到的Bacillus sp.(枯草桿菌)、Cytophaga sp.(噬細(xì)胞菌)以及Strepto-myces coelicolor(鏈霉菌)。 迄今為止，雖已有十幾種瓊膠酶得到了分離純化，但實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的卻只有從 Pseudomonaatlantica中分離的β-瓊膠酶,并且價(jià)格昂貴，應(yīng)用范圍也僅限于科研工作中，大大阻礙了瓊膠酶及瓊膠低聚糖的開發(fā)應(yīng)用。所以我們今后的工作重點(diǎn)應(yīng)是加強(qiáng)瓊膠酶的基礎(chǔ)性研究，拓寬瓊膠酶的來源，大力開發(fā)瓊膠酶酶解產(chǎn)物中具有活性功能的物質(zhì)，力求形成一個(gè)新的產(chǎn)業(yè)，一個(gè)新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)。
