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基本信息

項(xiàng)目名稱：
寡糖類疫苗合成方法學(xué)探究
小類：
生命科學(xué)
簡(jiǎn)介：
我們希望探究出一種比較好的合成寡糖類疫苗方法。 首先將固相有機(jī)合成和化學(xué)酶法合成有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，以大量的制備細(xì)胞表面糖苷用于糖生物學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)?；诿阜ê铣傻牟蛔?，我們?cè)O(shè)想通過(guò)可反復(fù)使用的連接臂將寡糖的還原端固定在樹(shù)脂上，使用非天然底物引入特殊基團(tuán)，先進(jìn)行酶法糖鏈延伸，再通過(guò)化學(xué)修飾合成特殊結(jié)構(gòu)的寡糖的策略。 之后，我們還設(shè)計(jì)了策略2-固相萃取法進(jìn)行合成。
詳細(xì)介紹：
第一代線性高分子載體的合成： 考慮到線性高分子要具有水溶性我們懸著丙烯酰胺，烯丙胺（10:1）為單體在過(guò)硫酸鉀60℃下聚合6h，得到白色固體樹(shù)脂1。具有極強(qiáng)的水溶性，但通過(guò)1H NMR分析烯丙胺比例非常少，為丙烯酰胺均聚產(chǎn)物，且不溶于DMF。以上這些缺點(diǎn)限制了我們對(duì)改高分子的進(jìn)一步修飾。 第二代線性高分子載體的合成 基于前一代高分子的失敗經(jīng)驗(yàn)，我們將極性較強(qiáng)的丙烯酰胺替換極性相對(duì)較小的N-異丙基丙烯酰胺，希望提高產(chǎn)物樹(shù)脂2在DMF中的水溶性。在DMF下，以AIBN為引發(fā)劑，60℃下聚合24h。反應(yīng)完成后透析除去DMF和引發(fā)劑等雜質(zhì)，凍干。得白色絮狀固體。產(chǎn)物水溶性和在DMF中的溶解性均很好。但通過(guò)1H NMR分析丙烯胺比例非常少，為N-異丙基丙烯酰胺均聚產(chǎn)物。該產(chǎn)物同樣不能進(jìn)行進(jìn)一步修飾。 第三代線性高分子載體的合成 基于前二代高分子的失敗經(jīng)驗(yàn)，我們將烯丙胺替換為N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯，在DMF下，以AIBN為引發(fā)劑，60℃下聚合24h。反應(yīng)完后逐滴加入20eq乙二胺，室溫?cái)嚢?4h，反應(yīng)完成后透析除去DMF和引發(fā)劑等雜質(zhì)，凍干。得白色絮狀樹(shù)脂3。產(chǎn)物水溶性和在DMF中的溶解性均很好。但通過(guò)1H NMR分析NH2比例與我們?cè)O(shè)計(jì)的相同。以下是所得到的高分子的氫譜，通過(guò)粘度計(jì)測(cè)定所得分子量范圍5KDa-10KDa。取代度20% 在Ar氣保護(hù)下，向150mg（1.2eq） NaH中加入18ml無(wú)水THF，和1ml 2-(Diethoxyphosphoryl)propionic acid ethyl ester（1eq），攪拌30min，加入α-Ketoglutaric acid diethyl ester（600mg， 3mmol），室溫?cái)嚢?h后，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全。加入10mlNH4Cl飽和溶液，以乙醚（20ml×3）萃取，合并有機(jī)相以無(wú)水硫酸鎂干燥，以石油醚：乙酸乙酯=10:1柱層析，得無(wú)色油狀物785mg，產(chǎn)率91%。 760mg 3-Pentene-1,3,4-tricarboxylic acid, 1,3,4-triethyl ester溶于22ml無(wú)水乙醇，6.5ml 2M KOH水溶液中，回流1h，加入20ml 水，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至沒(méi)有有機(jī)溶劑蒸出，以二氯甲烷洗滌水相（10ml×3），冰浴下以濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，攪拌20min，以乙酸乙酯萃?。?0ml×3）萃取，合并有機(jī)相，干燥后旋蒸。 將酸性敏感鏈交聯(lián)到線性樹(shù)脂上 將160mg 3-Pentene-1,3,4-tricarboxylic acid, cyclic 3,4-anhydride、76μL草酰氯溶于12ml無(wú)水THF中，室溫?cái)嚢?h。將反應(yīng)液旋干，溶于3ml無(wú)水DMF中，將150mg制備得到的樹(shù)脂3和122μL三乙胺溶于6ml無(wú)水DMF，將酰氯的DMF溶液逐滴滴入含有樹(shù)脂的溶液中室溫?cái)嚢?4h后，加入9ml水，以1M HCl調(diào)節(jié)pH值至2，室溫?cái)嚢?0min，以30%的乙醇透析，將透析液旋干得白色固體樹(shù)脂4，取代度15%?？梢悦黠@看到樹(shù)脂中酸酐的吸收信號(hào)1765.01，1715cm-1 全乙?；?-溴乙基β乳糖苷的制備 將6.36g 4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl), 2,3,6-triacetate-β-D-Galactopyranose溶于40ml二氯甲烷和三氯乙腈（5.68g，40mmol，4eq）。在-5 oC下逐滴加入DBU（0.42g,3mmol,0.1eq），室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全，溶液旋干后，經(jīng)柱層析（二氯甲烷：乙酸乙酯=20:1），得白色固體7g。將所得三氯亞胺酯供體和2-溴乙醇溶于40ml無(wú)水二氯甲烷中，在Ar氣保護(hù)下，-10oC加入TMSOTf（(0.1M, 0.13 mL, 0.02eq)的二氯甲烷溶液，室溫?cái)嚢?0min，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全，反應(yīng)以三乙胺猝滅，旋干，經(jīng)柱層析（石油醚：乙酸乙酯=2:1）得到白色全乙?；?-溴乙基β乳糖苷4.83g，兩部收率65% 全乙?；?-疊氮乙基β乳糖苷的制備 將1.6g 2-溴乙基β乳糖苷溶于21ml無(wú)水DMF，加入1.4g疊氮鈉（21.6mmol，10eq），25oC下攪拌24h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入冰水中，以二氯甲烷（40ml×3）萃取，干燥，旋干后得到全乙?；?-疊氮乙基β乳糖苷白色固體1.4g，產(chǎn)率95%。 2-疊氮乙基β乳糖苷的制備 將1.4g 全乙?；?-疊氮乙基β乳糖苷溶于20ml無(wú)水MeOH，以甲醇鈉調(diào)節(jié)pH值至8，25oC下攪拌30min，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全，以Dowex 50WX2調(diào)節(jié)pH值至7，過(guò)濾，旋干后得到2-疊氮乙基β乳糖苷白色固體690mg，產(chǎn)率85%。 將乳糖聯(lián)到樹(shù)脂上 2-疊氮乙基β乳糖苷690mg溶于10mlMeOH，加入50mg10%Pd/C，4atm下反應(yīng)30min。濾除Pd/C將反應(yīng)液旋干，加1ml水凍干，得白色絮狀固體600mg。取出100mg與330mg樹(shù)脂4溶于40ml無(wú)水DMF，加入200μL三乙胺，25oC下攪拌12h。以水透析得到，凍干得到白色絮狀固體樹(shù)脂5。經(jīng)1HNMR鑒定取代度約12%。樹(shù)脂具有水溶性。 一鍋多酶合成Siaα2-6Lac三糖 取樹(shù)脂4 60mg，加入NmCSS（1mg\ml）120μL，Pd Sia2,6T（1mg\ml）240μL,Tris-HCl（1M，pH=8.0）312μL，2.5mL雙蒸水，MgCl2（4.8mg，終濃度10mmol），CTP 25mg(1.5eq),唾液酸15mg，混合均勻。25oC下100rpm下，反應(yīng)12h。將反應(yīng)液煮沸5min，透析后，透析袋冰浴下以PB-10pH計(jì)檢測(cè)溶液pH值，以1M HCl調(diào)節(jié)pH值至3.5，25oC下100rpm下，反應(yīng)12h。將反應(yīng)液以12000rpm離心，上清以P2柱分離，得目標(biāo)化合物60mg，產(chǎn)率35%。

作品專業(yè)信息

撰寫(xiě)目的和基本思路

我們擬將固相有機(jī)合成和化學(xué)酶法合成有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，大量制備細(xì)胞表面糖苷用于糖生物學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)?；诿阜ê铣扇秉c(diǎn)，我們?cè)O(shè)想通過(guò)可反復(fù)使用的連接臂將寡糖的還原端固定在樹(shù)脂上，使用非天然底物引入特殊基團(tuán)，先進(jìn)行酶法糖鏈延伸，再通過(guò)化學(xué)修飾合成特殊結(jié)構(gòu)的寡糖的策略。 我組成功通過(guò)酶法合成Globo—H，我們考慮通過(guò)固相合成的策略簡(jiǎn)化分離純化步驟，提高產(chǎn)率。

科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處

策略1將固相有機(jī)合成和化學(xué)酶法合成有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1）我們可以通過(guò)超濾或透析等簡(jiǎn)單手段，去除反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的UDP，未反應(yīng)的供體的底物。然后，重新加入新的底物，推動(dòng)反應(yīng)接近完全。 2）如果某些步驟不適合固相反應(yīng)，由于連接臂可以反復(fù)使用，我們可以使用“take-off”的策略，不會(huì)影響后續(xù)固相合成 3）可以在酶法合成完成后，通過(guò)化學(xué)修飾得到特殊的結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義

本課題致力于開(kāi)發(fā)的基于固相的化學(xué)酶法合成方法及其固相萃取法，將有效的推動(dòng)糖化學(xué)，糖生物學(xué)及寡糖類藥物的研發(fā)，具有極高的理論價(jià)值。合成得到的寡糖類抗原及其糖蛋白復(fù)合物，很有潛力成為新一代的疫苗，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

學(xué)術(shù)論文摘要

建立一個(gè)基于對(duì)pH值敏感的水溶性聚合物的多糖的酶催化合成的總體戰(zhàn)略。在中性條件下，聚合物具有水溶性，并且利于酶催化反應(yīng)的進(jìn)行。而在酸性條件（pH值低于4.0），產(chǎn)品從聚合物中脫離，顯示出不溶解性，可以很容易地從反應(yīng)體系中分離出來(lái)。6-Sialyl LN的類似物就可以通過(guò)這種方法合成。

獲獎(jiǎng)情況

南開(kāi)大學(xué)本科生創(chuàng)新科研優(yōu)秀項(xiàng)目三等獎(jiǎng)

鑒定結(jié)果

無(wú)

參考文獻(xiàn)

Cancer Vaccine Globo-H carbohydrate antigens Solid phase Chemical Enzymatic Strategy Solid phase extraction technology

同類課題研究水平概述

近年來(lái)的研究表明，細(xì)胞表面的糖抗原的表達(dá)量通常在細(xì)胞癌化過(guò)程中大大增加，而且某些特定的寡聚糖只在某些特定的癌細(xì)胞上表達(dá)。例如，Globo—H通常在卵巢癌、胰腺癌，前列腺癌，乳腺癌和直腸癌中過(guò)量表達(dá)。因此寡糖抗原成為一種潛在的腫瘤疫苗分子。目前，以寡糖分子為基礎(chǔ)的一系列衍生物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。結(jié)果表明這種疫苗在絕大多數(shù)的病人體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并且沒(méi)有自免疫的副作用產(chǎn)生。 單糖結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾可以增加多糖疫苗的免疫原性。化學(xué)修飾的帶有非自然的N-acyl的側(cè)鏈的sialic aid殘基，與相應(yīng)的自然的sialic aid疫苗相比具有更強(qiáng)的免疫原性。Globo—H與KLH的復(fù)合物已進(jìn)行了臨產(chǎn)前的試驗(yàn)，正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。臨產(chǎn)前的試驗(yàn)結(jié)果表明，該糖蛋白復(fù)合物可有效的刺激人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體 發(fā)展寡糖類疫苗存在這三個(gè)技術(shù)瓶頸： 1）發(fā)展寡糖類疫苗的技術(shù)瓶頸之一：稀有單糖糖庫(kù)的構(gòu)建 寡糖抗原往往含有稀有的單糖，現(xiàn)有的單糖合成策略主要有兩條：“糖到糖”和“非糖到糖”。就合成設(shè)計(jì)而言，構(gòu)建糖庫(kù)比合成單一個(gè)體更具有挑戰(zhàn)性。對(duì)于構(gòu)建糖庫(kù)，好的合成設(shè)計(jì)往往需要有“收束性”（convergent design），即合成是從數(shù)目較少的關(guān)鍵中間體出發(fā)，經(jīng)過(guò)較短的路線來(lái)完成。目前為止，用于構(gòu)建糖庫(kù)的收束性設(shè)計(jì)鳳毛麟角。 2) 發(fā)展寡糖類疫苗的技術(shù)瓶頸之二：寡糖合成（酶法的應(yīng)用） 在生物大分子中，多肽和寡核苷酸的合成技術(shù)已經(jīng)十分成熟，自動(dòng)化的合成已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)應(yīng)用；相比之下，寡糖合成技術(shù)的發(fā)展卻大大滯后。主要原因是由于寡糖鏈的立體化學(xué)更為復(fù)雜；直鏈或支鏈、呋喃環(huán)間的多種連接方式以及糖苷鏈的α/β構(gòu)型等等因素。 寡糖的合成有化學(xué)和生物酶法合成兩種，他們相互優(yōu)劣，互為補(bǔ)充。酶法多用于合成某一特定的（天然）寡糖，如α-Gal，ABO血型抗原，志賀毒素(Shiga toxin)的受體Gb3等；化學(xué)法則更適合于（天然）寡糖的衍生化。 3) 發(fā)展寡糖類疫苗的技術(shù)瓶頸之三：刺激免疫的載體的選擇 寡糖類抗原是較弱的抗原，需要選擇合適的抗原才能刺激免疫反應(yīng)，現(xiàn)在選用的有BSA，KLH,TT,DT等。
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