基本信息
- 項目名稱：
- 天山凍土產低溫酶菌種分離及其系統(tǒng)發(fā)育研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本論文通過天對山凍土可培養(yǎng)細菌的分離和產低溫酶菌株的篩選，了解天山凍土微生物的物種多樣性和產酶菌株系統(tǒng)發(fā)育多樣性，為高效低溫酶生物技術奠定基礎。實驗采用稀濃度的R2A、TSB平板涂布分離天山凍土中可培養(yǎng)細菌；通過選擇性培養(yǎng)基篩選產低溫酶的菌株；通過16S rRNA基因序列分析確定產酶菌種的系統(tǒng)進化地位；通過BOX-PCR指紋技術對16S rRNA基因高度同源性的菌株進一步區(qū)分。
- 詳細介紹：
- 常溫環(huán)境中微生物所分泌酶類的最適反應溫度一般在40-60℃，在低溫條件下其催化效率大為降低。而來源于低溫微生物的低溫酶類最適反應溫度一般在25-45℃。低溫條件下具有高催化效率和高柔韌性分子構象，是低溫酶中普遍存在的酶學特性。與同類型中溫、高溫酶相比，低溫酶在低溫條件下具有更低的而值和更高的轉換系數Kcat或催化效率Kcat/Km，這表示酶在低溫下對底物具有更強的親和力。 目前，科學界對低溫酶的研究主要集中在酶的冷適應性機制、酶的結構與功能以及其在生物工程的應用等方面，并且已從低溫菌中分離純化了低溫酶，但對產低溫酶菌株開展的基礎性研究卻很少。因此篩選出優(yōu)質高效的產酶菌種是低溫酶的工業(yè)化生產的首要條件。優(yōu)良的菌種不僅能夠提高產酶量、提高發(fā)酵底物的利用率，還能夠縮短發(fā)酵周期、降低成本、改良發(fā)酵工藝，優(yōu)化出最適合的發(fā)酵條件，為今后的工業(yè)生產提供一系列參數。 低溫酶一般是由低溫微生物產生的，因而對于產低溫酶菌株的篩選是解決低溫酶來源的首要且基礎的問題。凍土被稱為低溫微生物的資源寶庫，因此從天山凍土中分離、純化低溫微生物對于篩選出優(yōu)質、高效的產酶菌株意義重大。 低溫酶體現出來的對底物強親和力、低溫下高催化效率、高酶活性、維持正常的生理機構和功能都與酶分子本身的氨基酸組成和一級結構有關。通過對低溫酶一級序列和高級結構的研究顯示，與同類型的中、高溫酶相比，低溫酶的共同特征是：甘氨酸、天冬氨酸殘基數量增加，而脯氨酸、精氨酸殘基數量減少；鹽橋、芳香環(huán)相互作用、疏水作用減弱；分子間、亞基間以及結構域間的相互作用減弱；使得酶與溶劑分子間的相互作用增強這些結構上的差異都賦予了低溫酶蛋白分子較高的柔韌性和較低的熱穩(wěn)定性，也是低溫酶能夠適應低溫的分子基礎，從而能夠更加適應低溫環(huán)境。 有關資料表明，低溫酶低溫下高酶活性幾乎總是與其熱不穩(wěn)定性相關酶的柔韌性是指蛋白質分子不同構象之間的轉化，柔韌性使得蛋白分子構象異構體數目增加，酶蛋白分子在低溫下可以通過改變構象，降低酶與底物結合的誘導契合過程中能量的消耗；酶的熱穩(wěn)定性是指酶在不同溫度下保持活力的能力，研究表明，中、高溫酶在室溫下催化效率低是因為此時酶的緊密構象阻礙了酶分子與底物之間的相互作用，而低溫酶的柔韌性能保證酶與底物的有效結合，但正是因為分子松散柔韌的結構導致了低溫酶的熱不穩(wěn)定性。 同中溫酶相比，低溫酶具有下面4個特征：(1)在較低的溫度下可以得到較多的酶。研究發(fā)現，低溫菌酶的產量常常在低于該菌最適生長溫度時最高。(2)低溫酶的最適作用溫度較常溫酶低。(3)低溫酶的比活力高，熱穩(wěn)定性差。(4)低溫酶的活化能低，使酶在低溫環(huán)境下更容易發(fā)揮催化作用，從而提高對底物的利用效率。 由于低溫酶的低溫催化能力，低熱穩(wěn)定性使其在工業(yè)應用上有以下優(yōu)勢：通過溫和處理使低溫酶失活，快速而經濟地終止反應；生產過程在低溫或室溫下進行，無需加熱和冷卻，可以降低成本；生產過程便于監(jiān)控。 本研究依托新疆獨特的地緣環(huán)境優(yōu)勢，從天山一號冰川冰層含冰凍土中分離、純化出產低溫酶（低溫淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和β-半乳糖苷酶）的菌株，以解決低溫酶的來源問題。通過對篩選出的菌株所產低溫酶的酶學性質及低溫菌株實驗室最佳發(fā)酵條件的研究，進一步了解低溫酶的性質，為低溫酶的基礎研究和工業(yè)化應用奠定一定的理論和實踐基礎。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究通過天山凍土細菌的分離和產低溫脂肪酶菌株的篩選，了解天山凍土微生物的物種多樣性和產脂肪酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，為高效低溫脂肪酶生物技術奠定基礎。依托新疆獨特的地緣環(huán)境，從天山一號冰川冰層含冰凍土中分離、純化出產低溫淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和β-半乳糖苷酶的菌株，并在此基礎上研究菌株所產低溫酶的酶學性質及菌株的實驗室發(fā)酵最優(yōu)條件，因而具有較高的理論研究價值和實際應用意義。
科學性、先進性及獨特之處
- 科學性：采用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基更適合凍土微生物的培養(yǎng)；采用多種方案篩選產酶菌株，產酶現象明顯；所得產酶菌株具有低溫、高效的特點 先進性：新疆天山凍土是天然的菌種保藏庫，低溫微生物資源豐富；所得產低溫酶微生物，多樣性豐富；后續(xù)可將低溫酶功能基因導入宿主細胞構建工程菌應用于工業(yè)化生產中。 獨特性：實驗方便可行，解決了酶的來源問題；天山凍土的特殊環(huán)境使篩選得到的產酶菌株具有低溫、高效、耐鹽、耐壓等特點。
應用價值和現實意義
- 低溫酶與中高溫酶相比，經過溫和的熱處理即可選擇性失活，可以大大縮短處理時間并省卻昂貴的加熱冷卻系統(tǒng)，其較低的活化能和反應最適溫度，也可節(jié)約能源、保護環(huán)境。在食品工業(yè)中，低溫β-半乳糖酶可用于生產低乳糖或者無乳糖乳制品；低溫蛋白酶可用于發(fā)酵食品的生產、奶酪的催熟，肉類加工中使用低溫蛋白酶可起到保鮮、使肉鮮嫩的作用；低溫淀粉酶在焙烤工業(yè)中可以縮短生面團發(fā)酵時間，提高面團和面包的質量。
學術論文摘要
- 摘要：【目的】通過天山凍土細菌的分離和產低溫脂肪酶菌株的篩選，了解天山凍土微生物的物種多樣性和產脂肪酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，為高效低溫脂肪酶生物技術奠定基礎?！痉椒ā坎捎孟舛鹊腞2A、TSB平板涂布分離天山凍土中可培養(yǎng)細菌，通過選擇性培養(yǎng)基篩選產低溫脂肪酶的菌株。采用細菌常規(guī)生理生化實驗、最適生長溫度、耐鹽性、產酶性能對分離菌株的生理學進行研究，通過16S rRNA基因序列分析確定產脂肪酶菌種的系統(tǒng)進化地位，通過BOX-PCR指紋技術對16S rRNA基因高度同源性的菌株進一步區(qū)分?！窘Y果】分離篩選到121株可培養(yǎng)低溫菌，選擇培養(yǎng)基顯示有17株可產低溫脂肪酶，3株低溫淀粉酶菌株，75株蛋白酶菌株，13株β-半乳糖苷酶菌株。產酶菌分別隸屬于5個系統(tǒng)發(fā)育類群、6個屬，其中假單胞菌屬(Pseudomonas)占大多數(58.9%)?！窘Y論】天山凍土中產低溫脂肪酶的細菌具有較豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，依據生長溫度，均屬于耐冷菌。
獲獎情況
- 1.徐宇麗, 王大偉, 劉 婭, 倪永清.天山凍土產低溫脂肪酶菌株的篩選及其多樣性研究.微生物學報 2011,2(51):233-240. 2.Yongqing Ni, Xuewei shi，Yuli Xu, Yan Ma, Ming Zhang and Guodong Cheng. Diversity and cold-active hydrolytic enzymes of culturable bacteria isolated from a permafrost soil in the Tianshan Mountains. Extremophiles. （Under review） 3.劉韜，馬燕，倪永清.分子生物學技術在食品工業(yè)中的最新研究進展.農產品加工2010,208:(5).
鑒定結果
- 暫無
參考文獻
- FEBS Letters; Annual Reviews Microbiology; European Journal of Biochemistry; Applied and Environmental Microbiology; 微生物學報; Biochemical engineering journal; Extremophiles; Bioresource Technology; Biotechnolgy and Applied Biochemistry; Journal of Agricultural and Food Chemistry.
同類課題研究水平概述
- 20世紀70年代開始，世界各國科學家的開始廣泛關注低溫微生物與其相關產物(如抗凍蛋白、低溫酶類、多聚不飽和脂肪酸(PUFA , polyunsaturated fatty acids)、色素、抗生素、抗腫瘤藥物以及質粒等)以及它們在生物工程中的潛在價值。主要研究涉及低溫微生物的冷適應機制、生命的起源與進化、新菌種的鑒定與菌種系統(tǒng)發(fā)育分析、物質的生物地球化學循環(huán)與能量傳遞以及新型生物活性物質的研究開發(fā)等方面。目前在低溫微生物研究領域，歐美及日本等一些傳統(tǒng)生物技術大國，已開展了多年的研究，在國際上處于領先地位：美國對來自極地及海洋的嗜冷微生物在低溫生存機制、生物工程潛在應用以及與天體生物學(Astrobiology)的聯系等方面開展了探索研究，并且首次完成了對1株北極耐冷細菌(Colwellia psychrerythraea 34H)的全基因組測序工作；加拿大科研人員對北極環(huán)境污染物(如鏈烷、甲苯、蔡、多氯聯苯等)降解細菌進行了大量研究；澳大利亞利用其毗鄰南極大陸的地理優(yōu)勢，先后對包括嗜冷菌、耐冷菌在內的南極及南大洋微生物資源進行了大規(guī)模的調查研究與收集保藏，不僅在低溫微生物的多樣性和適冷機制、生物環(huán)境修復等方面開展了許多工作，還在新型藥物篩選、低溫酶類及多聚不飽和脂肪酸的研究與開發(fā)應用方面進行了摸索；歐盟于1996年啟動了主要針對研究南極嗜冷微生物嗜冷酶的“Coldzyme”項目，研究方向主要包括酶的分子結構適冷機制，酶序列分析、酶分子定向誘變、酶基因克隆表達以及應用開發(fā)等方面。另外，他們對低溫微生物冷休克蛋白(CSP, cold shock protein)、特殊基因調控系統(tǒng)、特殊膜成分以及不同的分泌機制等方面也進行了重點研究。 我國從20世紀90年代初開始對低溫微生物資源(主要是南極及深海微生物)進行初步收集、調查與研究工作。中國水產科學院黃海水產所已研制開發(fā)出主要應用于合成洗滌劑方面的海洋低溫堿性蛋白酶和應用于醫(yī)療方面的低溫溶菌酶產品。白玉等從天山多年凍土地區(qū)分離、篩選出51株分別具有產低溫蛋白酶、低溫淀粉酶、低溫脂酶、低溫β-半乳糖苷酶特性的耐冷菌。在低溫微生物的理論和實際應用方面，我國雖起步較晚，但發(fā)展極為迅速。相信隨著世界各國科學技術的不斷進步以及相互交流的增加，我們對低溫微生物及其相關產物的研究將取得更加豐碩的成果。
