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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 天山凍土產(chǎn)低溫酶菌種分離及其系統(tǒng)發(fā)育研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本論文通過(guò)天對(duì)山凍土可培養(yǎng)細(xì)菌的分離和產(chǎn)低溫酶菌株的篩選，了解天山凍土微生物的物種多樣性和產(chǎn)酶菌株系統(tǒng)發(fā)育多樣性，為高效低溫酶生物技術(shù)奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)采用稀濃度的R2A、TSB平板涂布分離天山凍土中可培養(yǎng)細(xì)菌；通過(guò)選擇性培養(yǎng)基篩選產(chǎn)低溫酶的菌株；通過(guò)16S rRNA基因序列分析確定產(chǎn)酶菌種的系統(tǒng)進(jìn)化地位；通過(guò)BOX-PCR指紋技術(shù)對(duì)16S rRNA基因高度同源性的菌株進(jìn)一步區(qū)分。
- 詳細(xì)介紹：
- 常溫環(huán)境中微生物所分泌酶類的最適反應(yīng)溫度一般在40-60℃，在低溫條件下其催化效率大為降低。而來(lái)源于低溫微生物的低溫酶類最適反應(yīng)溫度一般在25-45℃。低溫條件下具有高催化效率和高柔韌性分子構(gòu)象，是低溫酶中普遍存在的酶學(xué)特性。與同類型中溫、高溫酶相比，低溫酶在低溫條件下具有更低的而值和更高的轉(zhuǎn)換系數(shù)Kcat或催化效率Kcat/Km，這表示酶在低溫下對(duì)底物具有更強(qiáng)的親和力。 目前，科學(xué)界對(duì)低溫酶的研究主要集中在酶的冷適應(yīng)性機(jī)制、酶的結(jié)構(gòu)與功能以及其在生物工程的應(yīng)用等方面，并且已從低溫菌中分離純化了低溫酶，但對(duì)產(chǎn)低溫酶菌株開(kāi)展的基礎(chǔ)性研究卻很少。因此篩選出優(yōu)質(zhì)高效的產(chǎn)酶菌種是低溫酶的工業(yè)化生產(chǎn)的首要條件。優(yōu)良的菌種不僅能夠提高產(chǎn)酶量、提高發(fā)酵底物的利用率，還能夠縮短發(fā)酵周期、降低成本、改良發(fā)酵工藝，優(yōu)化出最適合的發(fā)酵條件，為今后的工業(yè)生產(chǎn)提供一系列參數(shù)。 低溫酶一般是由低溫微生物產(chǎn)生的，因而對(duì)于產(chǎn)低溫酶菌株的篩選是解決低溫酶來(lái)源的首要且基礎(chǔ)的問(wèn)題。凍土被稱為低溫微生物的資源寶庫(kù)，因此從天山凍土中分離、純化低溫微生物對(duì)于篩選出優(yōu)質(zhì)、高效的產(chǎn)酶菌株意義重大。 低溫酶體現(xiàn)出來(lái)的對(duì)底物強(qiáng)親和力、低溫下高催化效率、高酶活性、維持正常的生理機(jī)構(gòu)和功能都與酶分子本身的氨基酸組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。通過(guò)對(duì)低溫酶一級(jí)序列和高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究顯示，與同類型的中、高溫酶相比，低溫酶的共同特征是：甘氨酸、天冬氨酸殘基數(shù)量增加，而脯氨酸、精氨酸殘基數(shù)量減少；鹽橋、芳香環(huán)相互作用、疏水作用減弱；分子間、亞基間以及結(jié)構(gòu)域間的相互作用減弱；使得酶與溶劑分子間的相互作用增強(qiáng)這些結(jié)構(gòu)上的差異都賦予了低溫酶蛋白分子較高的柔韌性和較低的熱穩(wěn)定性，也是低溫酶能夠適應(yīng)低溫的分子基礎(chǔ)，從而能夠更加適應(yīng)低溫環(huán)境。 有關(guān)資料表明，低溫酶低溫下高酶活性幾乎總是與其熱不穩(wěn)定性相關(guān)酶的柔韌性是指蛋白質(zhì)分子不同構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)化，柔韌性使得蛋白分子構(gòu)象異構(gòu)體數(shù)目增加，酶蛋白分子在低溫下可以通過(guò)改變構(gòu)象，降低酶與底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合過(guò)程中能量的消耗；酶的熱穩(wěn)定性是指酶在不同溫度下保持活力的能力，研究表明，中、高溫酶在室溫下催化效率低是因?yàn)榇藭r(shí)酶的緊密構(gòu)象阻礙了酶分子與底物之間的相互作用，而低溫酶的柔韌性能保證酶與底物的有效結(jié)合，但正是因?yàn)榉肿铀缮⑷犴g的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了低溫酶的熱不穩(wěn)定性。 同中溫酶相比，低溫酶具有下面4個(gè)特征：(1)在較低的溫度下可以得到較多的酶。研究發(fā)現(xiàn)，低溫菌酶的產(chǎn)量常常在低于該菌最適生長(zhǎng)溫度時(shí)最高。(2)低溫酶的最適作用溫度較常溫酶低。(3)低溫酶的比活力高，熱穩(wěn)定性差。(4)低溫酶的活化能低，使酶在低溫環(huán)境下更容易發(fā)揮催化作用，從而提高對(duì)底物的利用效率。 由于低溫酶的低溫催化能力，低熱穩(wěn)定性使其在工業(yè)應(yīng)用上有以下優(yōu)勢(shì)：通過(guò)溫和處理使低溫酶失活，快速而經(jīng)濟(jì)地終止反應(yīng)；生產(chǎn)過(guò)程在低溫或室溫下進(jìn)行，無(wú)需加熱和冷卻，可以降低成本；生產(chǎn)過(guò)程便于監(jiān)控。 本研究依托新疆獨(dú)特的地緣環(huán)境優(yōu)勢(shì)，從天山一號(hào)冰川冰層含冰凍土中分離、純化出產(chǎn)低溫酶（低溫淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和β-半乳糖苷酶）的菌株，以解決低溫酶的來(lái)源問(wèn)題。通過(guò)對(duì)篩選出的菌株所產(chǎn)低溫酶的酶學(xué)性質(zhì)及低溫菌株實(shí)驗(yàn)室最佳發(fā)酵條件的研究，進(jìn)一步了解低溫酶的性質(zhì)，為低溫酶的基礎(chǔ)研究和工業(yè)化應(yīng)用奠定一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究通過(guò)天山凍土細(xì)菌的分離和產(chǎn)低溫脂肪酶菌株的篩選，了解天山凍土微生物的物種多樣性和產(chǎn)脂肪酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，為高效低溫脂肪酶生物技術(shù)奠定基礎(chǔ)。依托新疆獨(dú)特的地緣環(huán)境，從天山一號(hào)冰川冰層含冰凍土中分離、純化出產(chǎn)低溫淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和β-半乳糖苷酶的菌株，并在此基礎(chǔ)上研究菌株所產(chǎn)低溫酶的酶學(xué)性質(zhì)及菌株的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵最優(yōu)條件，因而具有較高的理論研究?jī)r(jià)值和實(shí)際應(yīng)用意義。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 科學(xué)性：采用寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基更適合凍土微生物的培養(yǎng)；采用多種方案篩選產(chǎn)酶菌株，產(chǎn)酶現(xiàn)象明顯；所得產(chǎn)酶菌株具有低溫、高效的特點(diǎn) 先進(jìn)性：新疆天山凍土是天然的菌種保藏庫(kù)，低溫微生物資源豐富；所得產(chǎn)低溫酶微生物，多樣性豐富；后續(xù)可將低溫酶功能基因?qū)胨拗骷?xì)胞構(gòu)建工程菌應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。 獨(dú)特性：實(shí)驗(yàn)方便可行，解決了酶的來(lái)源問(wèn)題；天山凍土的特殊環(huán)境使篩選得到的產(chǎn)酶菌株具有低溫、高效、耐鹽、耐壓等特點(diǎn)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 低溫酶與中高溫酶相比，經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可選擇性失活，可以大大縮短處理時(shí)間并省卻昂貴的加熱冷卻系統(tǒng)，其較低的活化能和反應(yīng)最適溫度，也可節(jié)約能源、保護(hù)環(huán)境。在食品工業(yè)中，低溫β-半乳糖酶可用于生產(chǎn)低乳糖或者無(wú)乳糖乳制品；低溫蛋白酶可用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)、奶酪的催熟，肉類加工中使用低溫蛋白酶可起到保鮮、使肉鮮嫩的作用；低溫淀粉酶在焙烤工業(yè)中可以縮短生面團(tuán)發(fā)酵時(shí)間，提高面團(tuán)和面包的質(zhì)量。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 摘要：【目的】通過(guò)天山凍土細(xì)菌的分離和產(chǎn)低溫脂肪酶菌株的篩選，了解天山凍土微生物的物種多樣性和產(chǎn)脂肪酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，為高效低溫脂肪酶生物技術(shù)奠定基礎(chǔ)。【方法】采用稀濃度的R2A、TSB平板涂布分離天山凍土中可培養(yǎng)細(xì)菌，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基篩選產(chǎn)低溫脂肪酶的菌株。采用細(xì)菌常規(guī)生理生化實(shí)驗(yàn)、最適生長(zhǎng)溫度、耐鹽性、產(chǎn)酶性能對(duì)分離菌株的生理學(xué)進(jìn)行研究，通過(guò)16S rRNA基因序列分析確定產(chǎn)脂肪酶菌種的系統(tǒng)進(jìn)化地位，通過(guò)BOX-PCR指紋技術(shù)對(duì)16S rRNA基因高度同源性的菌株進(jìn)一步區(qū)分?！窘Y(jié)果】分離篩選到121株可培養(yǎng)低溫菌，選擇培養(yǎng)基顯示有17株可產(chǎn)低溫脂肪酶，3株低溫淀粉酶菌株，75株蛋白酶菌株，13株β-半乳糖苷酶菌株。產(chǎn)酶菌分別隸屬于5個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類群、6個(gè)屬，其中假單胞菌屬(Pseudomonas)占大多數(shù)(58.9%)。【結(jié)論】天山凍土中產(chǎn)低溫脂肪酶的細(xì)菌具有較豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，依據(jù)生長(zhǎng)溫度，均屬于耐冷菌。
獲獎(jiǎng)情況
- 1.徐宇麗, 王大偉, 劉 婭, 倪永清.天山凍土產(chǎn)低溫脂肪酶菌株的篩選及其多樣性研究.微生物學(xué)報(bào) 2011,2(51):233-240. 2.Yongqing Ni, Xuewei shi，Yuli Xu, Yan Ma, Ming Zhang and Guodong Cheng. Diversity and cold-active hydrolytic enzymes of culturable bacteria isolated from a permafrost soil in the Tianshan Mountains. Extremophiles. （Under review） 3.劉韜，馬燕，倪永清.分子生物學(xué)技術(shù)在食品工業(yè)中的最新研究進(jìn)展.農(nóng)產(chǎn)品加工2010,208:(5).
鑒定結(jié)果
- 暫無(wú)
參考文獻(xiàn)
- FEBS Letters; Annual Reviews Microbiology; European Journal of Biochemistry; Applied and Environmental Microbiology; 微生物學(xué)報(bào); Biochemical engineering journal; Extremophiles; Bioresource Technology; Biotechnolgy and Applied Biochemistry; Journal of Agricultural and Food Chemistry.
同類課題研究水平概述
- 20世紀(jì)70年代開(kāi)始，世界各國(guó)科學(xué)家的開(kāi)始廣泛關(guān)注低溫微生物與其相關(guān)產(chǎn)物(如抗凍蛋白、低溫酶類、多聚不飽和脂肪酸(PUFA , polyunsaturated fatty acids)、色素、抗生素、抗腫瘤藥物以及質(zhì)粒等)以及它們?cè)谏锕こ讨械臐撛趦r(jià)值。主要研究涉及低溫微生物的冷適應(yīng)機(jī)制、生命的起源與進(jìn)化、新菌種的鑒定與菌種系統(tǒng)發(fā)育分析、物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)與能量傳遞以及新型生物活性物質(zhì)的研究開(kāi)發(fā)等方面。目前在低溫微生物研究領(lǐng)域，歐美及日本等一些傳統(tǒng)生物技術(shù)大國(guó)，已開(kāi)展了多年的研究，在國(guó)際上處于領(lǐng)先地位：美國(guó)對(duì)來(lái)自極地及海洋的嗜冷微生物在低溫生存機(jī)制、生物工程潛在應(yīng)用以及與天體生物學(xué)(Astrobiology)的聯(lián)系等方面開(kāi)展了探索研究，并且首次完成了對(duì)1株北極耐冷細(xì)菌(Colwellia psychrerythraea 34H)的全基因組測(cè)序工作；加拿大科研人員對(duì)北極環(huán)境污染物(如鏈烷、甲苯、蔡、多氯聯(lián)苯等)降解細(xì)菌進(jìn)行了大量研究；澳大利亞利用其毗鄰南極大陸的地理優(yōu)勢(shì)，先后對(duì)包括嗜冷菌、耐冷菌在內(nèi)的南極及南大洋微生物資源進(jìn)行了大規(guī)模的調(diào)查研究與收集保藏，不僅在低溫微生物的多樣性和適冷機(jī)制、生物環(huán)境修復(fù)等方面開(kāi)展了許多工作，還在新型藥物篩選、低溫酶類及多聚不飽和脂肪酸的研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面進(jìn)行了摸索；歐盟于1996年啟動(dòng)了主要針對(duì)研究南極嗜冷微生物嗜冷酶的“Coldzyme”項(xiàng)目，研究方向主要包括酶的分子結(jié)構(gòu)適冷機(jī)制，酶序列分析、酶分子定向誘變、酶基因克隆表達(dá)以及應(yīng)用開(kāi)發(fā)等方面。另外，他們對(duì)低溫微生物冷休克蛋白(CSP, cold shock protein)、特殊基因調(diào)控系統(tǒng)、特殊膜成分以及不同的分泌機(jī)制等方面也進(jìn)行了重點(diǎn)研究。 我國(guó)從20世紀(jì)90年代初開(kāi)始對(duì)低溫微生物資源(主要是南極及深海微生物)進(jìn)行初步收集、調(diào)查與研究工作。中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)所已研制開(kāi)發(fā)出主要應(yīng)用于合成洗滌劑方面的海洋低溫堿性蛋白酶和應(yīng)用于醫(yī)療方面的低溫溶菌酶產(chǎn)品。白玉等從天山多年凍土地區(qū)分離、篩選出51株分別具有產(chǎn)低溫蛋白酶、低溫淀粉酶、低溫脂酶、低溫β-半乳糖苷酶特性的耐冷菌。在低溫微生物的理論和實(shí)際應(yīng)用方面，我國(guó)雖起步較晚，但發(fā)展極為迅速。相信隨著世界各國(guó)科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步以及相互交流的增加，我們對(duì)低溫微生物及其相關(guān)產(chǎn)物的研究將取得更加豐碩的成果。
