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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 大型工業(yè)叢生用竹——梁山慈竹離體培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 造紙業(yè)是一個(gè)國(guó)家的重要產(chǎn)業(yè)。但以林木為主的木漿生產(chǎn)所需的纖維原料受到嚴(yán)重限制，而竹漿優(yōu)于草漿接近于木漿，是造紙優(yōu)質(zhì)的纖維原料。由于造紙過程中為脫去木質(zhì)素而產(chǎn)生的黑液造成嚴(yán)重環(huán)境污染。目前在慈竹上克隆了相關(guān)木質(zhì)素合成酶基因，但均未能在竹上得到表達(dá)，主要瓶頸在于缺少竹再生體系。因此，本研究建立了梁山慈竹愈傷組織培養(yǎng)與再生體系，并構(gòu)建梁山慈竹4CLRNAi植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌浸染，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。
- 詳細(xì)介紹：
- 本研究以梁山慈竹種胚和無菌苗不同部位為外植體，以MS和WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同的激素配比，對(duì)梁山慈竹組織培養(yǎng)和再生體系進(jìn)行了研究。同時(shí)構(gòu)建了慈竹木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因4CL的RNA干涉載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化梁山慈竹愈傷組織，最終獲得梁山慈竹轉(zhuǎn)基因植株。主要內(nèi)容如下： 1、梁山慈竹愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生體系的建立 以四川瀘州梁山慈竹種子為材料，MS和WPM為基本培養(yǎng)基進(jìn)行種子成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)、增殖；叢芽誘導(dǎo)、分化；植株再生；移栽一系列的研究，建立梁山慈竹組織培養(yǎng)及植株再生體系。 2、慈竹4CL RNAi載體的構(gòu)建 從慈竹幼筍cDNA中克隆Na4CL基因（Genbank：EU327341）保守區(qū)約600 bp片段，利用中間載體pSK-int和植物雙元載體pBI121上的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建慈竹4CL基因的RNAi植物表達(dá)載體pBI-4CL-RNAi。 3、慈竹4CL RNAi植物表達(dá)載體對(duì)梁山慈竹的遺傳轉(zhuǎn)化研究 將構(gòu)建好的pBI-4CL-RNAi質(zhì)粒利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染梁山慈竹愈傷組織，對(duì)篩選培養(yǎng)基上抗性愈傷組織進(jìn)行PCR檢測(cè)。 研究結(jié)果表明，MS誘導(dǎo)效果優(yōu)于WPM，MS2培養(yǎng)基更有利于愈傷組織的發(fā)生。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染梁山慈竹愈傷組織，篩選一個(gè)月后，獲得了抗性愈傷組織。PCR檢測(cè)初步證明RNAi載體已導(dǎo)入梁山慈竹抗性愈傷組織基因組中，為獲得木質(zhì)素含量降低的梁山慈竹轉(zhuǎn)基因植株，紙漿用竹改良和竹功能基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 在紙漿生產(chǎn)過程中為了脫去木質(zhì)素而耗費(fèi)了大量的能源和原料，產(chǎn)生的造紙黑液嚴(yán)重污染環(huán)境，制約著造紙業(yè)的發(fā)展。我國(guó)西南地區(qū)擁有豐富的竹子資源。竹纖維優(yōu)于草漿接近于木漿，降低木質(zhì)素或改變其組分，有利于我國(guó)竹子造紙業(yè)進(jìn)入一個(gè)嶄新的階段。竹遺傳轉(zhuǎn)化研究的主要瓶頸在于缺少竹離體愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生體系。因此，本研究建立梁山慈竹愈傷組織培養(yǎng)及再生體系。力求通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法為造紙業(yè)發(fā)展尋找新的方法和途徑。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 前人有關(guān)改良梁山慈竹基因組的研究都停留在理論階段。由本研究建立的梁山慈竹再生體系對(duì)竹類改良和竹功能基因組研究和創(chuàng)造適合我國(guó)國(guó)情的環(huán)保型低木質(zhì)素的紙漿用竹奠定基礎(chǔ)。本課題以梁山慈竹為研究對(duì)象，運(yùn)用RNA干涉技術(shù)調(diào)控靶基因4CL的表達(dá)。梁山慈竹的4CL基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)在本土梁山慈竹中成功的應(yīng)用，在梁山慈竹的改良史上是首例，擴(kuò)大了 4CL基因的應(yīng)用范圍。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- （1）為竹的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。 （2）為竹類改良和竹功能基因組學(xué)研究提供了平臺(tái)。 （3）為創(chuàng)造適合我國(guó)國(guó)情的環(huán)保型紙漿用竹提供了依據(jù)。 （4）同時(shí)，本研究還可用于編織、紡織等行業(yè)，完善產(chǎn)業(yè)鏈。有利于生態(tài)保護(hù)，帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 梁山慈竹是生產(chǎn)竹漿的優(yōu)良纖維原料，但在竹漿生產(chǎn)過程中為了脫去竹木質(zhì)素加入大量的強(qiáng)酸強(qiáng)堿等化工原料，造成成本增加和環(huán)境污染。通過生物技術(shù)手段培育木質(zhì)素含量低的竹種，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。竹類遺傳轉(zhuǎn)化的主要瓶頸在于缺少竹再生體系。本研究以梁山慈竹種胚和無菌苗不同部位為外植體，對(duì)梁山慈竹組織培養(yǎng)和再生體系進(jìn)行了研究，同時(shí)構(gòu)建了慈竹木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因4CL的RNA干涉載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化梁山慈竹愈傷組織，最終得到轉(zhuǎn)基因再生植株。 組織培養(yǎng)結(jié)果表明：MS2培養(yǎng)基更有利于愈傷組織的發(fā)生。種胚接種3天后開始膨大，進(jìn)入愈傷組織誘導(dǎo)啟動(dòng)期；15天左右進(jìn)入分裂期；30天后進(jìn)入分化期，形成疏松易碎、增殖能力強(qiáng)的顆粒狀愈傷組織，發(fā)生率高達(dá)96%。在MS2上，以梁山慈竹無菌苗不同部位為外植體也能誘導(dǎo)出愈傷組織，并形成再生植株，嫩芽和幼嫩帶節(jié)莖段誘導(dǎo)效果較好。 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染梁山慈竹愈傷組織，獲得了抗性愈傷組織，最終得到轉(zhuǎn)基因再生植株。經(jīng)PCR檢測(cè)證明采用RNAi技術(shù)已將4CL基因?qū)肓荷酱戎裨偕仓?，為紙漿用竹的改良和竹功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
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同類課題研究水平概述
- 1．竹類木質(zhì)素生物合成相關(guān)酶基因的研究現(xiàn)狀 與其他植物相比，竹類植物木質(zhì)素生物合成酶相關(guān)基因的研究十分滯后。目前僅在慈竹、綠竹、毛竹上有相關(guān)基因克隆的報(bào)道。 已從綠竹中克隆了BoCCoAOMT1和BoCOMT1基因 ，從毛竹中克隆了一個(gè)CCoAOMT1、CCoAOMT2、C4H和4CL基因 ，5個(gè)CCR基因、5個(gè)CAD基因、1個(gè)C3H基因。 2008年和2010年本研究室從大型叢生竹慈竹中分別成功克隆了一個(gè)4CL基因全長(zhǎng)編碼序列（GenBank ：EU327341）。但以上研究所獲得的相關(guān)竹木質(zhì)素合成酶基因均未能在竹上得到表達(dá)、驗(yàn)證與應(yīng)用，尤其是在大型工業(yè)紙漿用竹上。制約竹相關(guān)基因表達(dá)與調(diào)控及其在遺傳改良方面應(yīng)用的主要瓶頸在于缺少竹離體愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生體系，尤其是遺傳轉(zhuǎn)化體系。因此，建立工業(yè)紙漿用大型叢生竹離體培養(yǎng)再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化研究十分必要。 2.RNAi在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用 結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因植株Klason木質(zhì)素含量與對(duì)照相比平均降低了9.86%,綜纖維素含量與對(duì)照相比平均增加了3.17%,纖維長(zhǎng)寬比明顯增加,均表明轉(zhuǎn)基因植株更有利于造紙。Li等利用RNAi技術(shù)研究了棉花纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)過程中的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的作用。結(jié)果顯示：在目的基因被沉默的陽性植株中，mRNA和相關(guān)蛋白質(zhì)含量顯著降低，纖維中細(xì)胞骨架也遭到破壞，纖維的伸長(zhǎng)也被特異性抑制。 3.4CL基因的研究現(xiàn)狀 胡尚連、曹穎等參照其他物種4CL基因保守區(qū),設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,以慈竹幼筍cDNA為模板,克隆到1條750 bp的4CL基因保守區(qū)片段。以這條保守區(qū)片段為模板,結(jié)合5′RACE和3′RACE克隆4CL基因全長(zhǎng)序列,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果成功克隆了慈竹4CL基因全序列,并在GenBank上注冊(cè)為EU327341。黃圣雄、胡尚連等利用收集得到的50條4CL基因完整cDNA序列，構(gòu)建了4CL基因的系統(tǒng)發(fā)生樹,揭示了4CL基因的保守性和分化的事實(shí)。周建英等人通過RNAi技術(shù)將pSK-4CL-RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中并明顯降低了煙草的木質(zhì)素含量。李良、王小兵等人通過研究麥芽、絲瓜、土豆、大豆4CL基因活性，并與4種植物中總黃酮和總木質(zhì)素的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明：4CL活性與總黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系而與總木質(zhì)素含量呈一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系。
