基本信息
- 項目名稱：
- 大型工業(yè)叢生用竹——梁山慈竹離體培養(yǎng)及遺傳轉化研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 造紙業(yè)是一個國家的重要產(chǎn)業(yè)。但以林木為主的木漿生產(chǎn)所需的纖維原料受到嚴重限制，而竹漿優(yōu)于草漿接近于木漿，是造紙優(yōu)質(zhì)的纖維原料。由于造紙過程中為脫去木質(zhì)素而產(chǎn)生的黑液造成嚴重環(huán)境污染。目前在慈竹上克隆了相關木質(zhì)素合成酶基因，但均未能在竹上得到表達，主要瓶頸在于缺少竹再生體系。因此，本研究建立了梁山慈竹愈傷組織培養(yǎng)與再生體系，并構建梁山慈竹4CLRNAi植物表達載體，通過農(nóng)桿菌浸染，獲得了轉基因植株。
- 詳細介紹：
- 本研究以梁山慈竹種胚和無菌苗不同部位為外植體，以MS和WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同的激素配比，對梁山慈竹組織培養(yǎng)和再生體系進行了研究。同時構建了慈竹木質(zhì)素合成關鍵酶基因4CL的RNA干涉載體，并通過農(nóng)桿菌介導法轉化梁山慈竹愈傷組織，最終獲得梁山慈竹轉基因植株。主要內(nèi)容如下： 1、梁山慈竹愈傷組織誘導及植株再生體系的建立 以四川瀘州梁山慈竹種子為材料，MS和WPM為基本培養(yǎng)基進行種子成熟胚愈傷組織誘導、增殖；叢芽誘導、分化；植株再生；移栽一系列的研究，建立梁山慈竹組織培養(yǎng)及植株再生體系。 2、慈竹4CL RNAi載體的構建 從慈竹幼筍cDNA中克隆Na4CL基因（Genbank：EU327341）保守區(qū)約600 bp片段，利用中間載體pSK-int和植物雙元載體pBI121上的酶切位點，構建慈竹4CL基因的RNAi植物表達載體pBI-4CL-RNAi。 3、慈竹4CL RNAi植物表達載體對梁山慈竹的遺傳轉化研究 將構建好的pBI-4CL-RNAi質(zhì)粒利用農(nóng)桿菌介導法侵染梁山慈竹愈傷組織，對篩選培養(yǎng)基上抗性愈傷組織進行PCR檢測。 研究結果表明，MS誘導效果優(yōu)于WPM，MS2培養(yǎng)基更有利于愈傷組織的發(fā)生。采用農(nóng)桿菌介導法侵染梁山慈竹愈傷組織，篩選一個月后，獲得了抗性愈傷組織。PCR檢測初步證明RNAi載體已導入梁山慈竹抗性愈傷組織基因組中，為獲得木質(zhì)素含量降低的梁山慈竹轉基因植株，紙漿用竹改良和竹功能基因組學研究奠定基礎。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 在紙漿生產(chǎn)過程中為了脫去木質(zhì)素而耗費了大量的能源和原料，產(chǎn)生的造紙黑液嚴重污染環(huán)境，制約著造紙業(yè)的發(fā)展。我國西南地區(qū)擁有豐富的竹子資源。竹纖維優(yōu)于草漿接近于木漿，降低木質(zhì)素或改變其組分，有利于我國竹子造紙業(yè)進入一個嶄新的階段。竹遺傳轉化研究的主要瓶頸在于缺少竹離體愈傷組織誘導與植株再生體系。因此，本研究建立梁山慈竹愈傷組織培養(yǎng)及再生體系。力求通過遺傳轉化的方法為造紙業(yè)發(fā)展尋找新的方法和途徑。
科學性、先進性及獨特之處
- 前人有關改良梁山慈竹基因組的研究都停留在理論階段。由本研究建立的梁山慈竹再生體系對竹類改良和竹功能基因組研究和創(chuàng)造適合我國國情的環(huán)保型低木質(zhì)素的紙漿用竹奠定基礎。本課題以梁山慈竹為研究對象，運用RNA干涉技術調(diào)控靶基因4CL的表達。梁山慈竹的4CL基因轉導技術在本土梁山慈竹中成功的應用，在梁山慈竹的改良史上是首例，擴大了 4CL基因的應用范圍。
應用價值和現(xiàn)實意義
- （1）為竹的遺傳轉化研究奠定了基礎。 （2）為竹類改良和竹功能基因組學研究提供了平臺。 （3）為創(chuàng)造適合我國國情的環(huán)保型紙漿用竹提供了依據(jù)。 （4）同時，本研究還可用于編織、紡織等行業(yè)，完善產(chǎn)業(yè)鏈。有利于生態(tài)保護，帶來巨大經(jīng)濟效益。
學術論文摘要
- 梁山慈竹是生產(chǎn)竹漿的優(yōu)良纖維原料，但在竹漿生產(chǎn)過程中為了脫去竹木質(zhì)素加入大量的強酸強堿等化工原料，造成成本增加和環(huán)境污染。通過生物技術手段培育木質(zhì)素含量低的竹種，具有巨大的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。竹類遺傳轉化的主要瓶頸在于缺少竹再生體系。本研究以梁山慈竹種胚和無菌苗不同部位為外植體，對梁山慈竹組織培養(yǎng)和再生體系進行了研究，同時構建了慈竹木質(zhì)素合成關鍵酶基因4CL的RNA干涉載體，并通過農(nóng)桿菌介導法轉化梁山慈竹愈傷組織，最終得到轉基因再生植株。 組織培養(yǎng)結果表明：MS2培養(yǎng)基更有利于愈傷組織的發(fā)生。種胚接種3天后開始膨大，進入愈傷組織誘導啟動期；15天左右進入分裂期；30天后進入分化期，形成疏松易碎、增殖能力強的顆粒狀愈傷組織，發(fā)生率高達96%。在MS2上，以梁山慈竹無菌苗不同部位為外植體也能誘導出愈傷組織，并形成再生植株，嫩芽和幼嫩帶節(jié)莖段誘導效果較好。 采用農(nóng)桿菌介導法侵染梁山慈竹愈傷組織，獲得了抗性愈傷組織，最終得到轉基因再生植株。經(jīng)PCR檢測證明采用RNAi技術已將4CL基因導入梁山慈竹再生植株，為紙漿用竹的改良和竹功能基因組學研究奠定了基礎。
獲獎情況
- 無
鑒定結果
- 無
參考文獻
- [1] 魏建華, 宋艷茹. 木質(zhì)素生物合成途徑及調(diào)控的研究進展[J]. 植物學報, 2001, 43(8): 771-779. [2] 胡尚連, 曹穎, 賈舉慶. GA3對慈竹木質(zhì)素和纖維素動態(tài)積累及PAL酶活性調(diào)控的效應[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學, 2008, 47(8): 930-932. [3] Marita J M, Ralph J, Hatfield R D, Chapple C. NMR characterization of lignins in Arabidopsis altered in the activity of ferulate 5-hydroxylase[J]. P NATL ACAD SCI USA, 1999, 96: 12328-12332. [4] Ralf M?ller, Diane Steward, et.al. Gene silencing of cinnamyl alcohol dehydrogenase in Pinus radiata callus cultures[J]. PLANT PHYSIOL BIOCH, 2005, 43: 1061-1066. [5] 曾榮, 羅學剛, 譚向紅, 等. 竹木質(zhì)素研究進展[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學學報, 2004, 22(3): 274-277. [6] 賈舉慶, 胡尚連, 孫霞, 等. 四川2種叢生竹木質(zhì)素和纖維含量的研究[J]. 西北植物學報, 2007, 27(1): 197-200. [7] 張猛, 胡尚連, 賈舉慶. 施肥對慈竹灰分苯醇抽出物和木質(zhì)素含量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2008, 36(1): 246-247. [8] 胡尚連, 曹穎, 盧學琴, 等. 氮鉀對慈竹纖維素和木質(zhì)素動態(tài)積累的調(diào)控效應[J].植物研究, 2009, 29(6): 728-733. [9]胡尚連, 曹穎, 賈舉慶. GA3對慈竹木質(zhì)素和纖維素動態(tài)積累及PAL酶活性調(diào)控的效應[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學, 2008, 47(8): 930-932. [10] 范丙友, 陸海, 蔣湘寧. 維管植物4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL)研究進展[J]. 林業(yè)科學, 2007, 43(2): 96-103.
同類課題研究水平概述
- 1．竹類木質(zhì)素生物合成相關酶基因的研究現(xiàn)狀 與其他植物相比，竹類植物木質(zhì)素生物合成酶相關基因的研究十分滯后。目前僅在慈竹、綠竹、毛竹上有相關基因克隆的報道。 已從綠竹中克隆了BoCCoAOMT1和BoCOMT1基因 ，從毛竹中克隆了一個CCoAOMT1、CCoAOMT2、C4H和4CL基因 ，5個CCR基因、5個CAD基因、1個C3H基因。 2008年和2010年本研究室從大型叢生竹慈竹中分別成功克隆了一個4CL基因全長編碼序列（GenBank ：EU327341）。但以上研究所獲得的相關竹木質(zhì)素合成酶基因均未能在竹上得到表達、驗證與應用，尤其是在大型工業(yè)紙漿用竹上。制約竹相關基因表達與調(diào)控及其在遺傳改良方面應用的主要瓶頸在于缺少竹離體愈傷組織誘導與植株再生體系，尤其是遺傳轉化體系。因此，建立工業(yè)紙漿用大型叢生竹離體培養(yǎng)再生體系和遺傳轉化研究十分必要。 2.RNAi在遺傳轉化中的應用 結果顯示:轉基因植株Klason木質(zhì)素含量與對照相比平均降低了9.86%,綜纖維素含量與對照相比平均增加了3.17%,纖維長寬比明顯增加,均表明轉基因植株更有利于造紙。Li等利用RNAi技術研究了棉花纖維細胞伸長過程中的細胞骨架肌動蛋白的作用。結果顯示：在目的基因被沉默的陽性植株中，mRNA和相關蛋白質(zhì)含量顯著降低，纖維中細胞骨架也遭到破壞，纖維的伸長也被特異性抑制。 3.4CL基因的研究現(xiàn)狀 胡尚連、曹穎等參照其他物種4CL基因保守區(qū),設計簡并引物,以慈竹幼筍cDNA為模板,克隆到1條750 bp的4CL基因保守區(qū)片段。以這條保守區(qū)片段為模板,結合5′RACE和3′RACE克隆4CL基因全長序列,并對其進行了生物信息學分析。結果成功克隆了慈竹4CL基因全序列,并在GenBank上注冊為EU327341。黃圣雄、胡尚連等利用收集得到的50條4CL基因完整cDNA序列，構建了4CL基因的系統(tǒng)發(fā)生樹,揭示了4CL基因的保守性和分化的事實。周建英等人通過RNAi技術將pSK-4CL-RNAi表達載體轉入煙草中并明顯降低了煙草的木質(zhì)素含量。李良、王小兵等人通過研究麥芽、絲瓜、土豆、大豆4CL基因活性，并與4種植物中總黃酮和總木質(zhì)素的含量進行相關性分析，結果表明：4CL活性與總黃酮含量呈正相關關系而與總木質(zhì)素含量呈一定的負相關關系。
