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基本信息
- 項目名稱：
- 兔皮中6種條件性致病菌16s rDNA PCR-RFLP指紋圖譜分析方法的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 動物皮毛中含有大量細(xì)菌，有一部分細(xì)菌為人畜共患，對從事皮毛加工人員的身體健康構(gòu)成了很大威脅。16S rDNA是細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最常用的分子鐘，種類少、含量大、分子大小適中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域。本研究以此為指導(dǎo)，以細(xì)菌的16s rDNA為研究目標(biāo)，采用PCR-RFLP技術(shù)，對兔皮中分離到的6種細(xì)菌在分子水平上進(jìn)行鑒定，以期開發(fā)出一種準(zhǔn)確、快速的檢測方法。
- 詳細(xì)介紹：
- 動物皮毛中含有大量的細(xì)菌，多數(shù)情況下為非致病菌，但也有一部分細(xì)菌為人畜共患。這些有害細(xì)菌的存在對于從事皮毛加工人員的身體健康構(gòu)成了很大的威脅。 16S rDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中最常用的分子鐘，其種類少，含量大（約占細(xì)菌RNA含量的80％），分子大小適中。16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性。然而在16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域。根據(jù)各種細(xì)菌的16S rDNA可變區(qū)進(jìn)行細(xì)菌鑒定已應(yīng)用到各領(lǐng)域的微生物鑒定中。 PCR-RFLP是將PCR方法與限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）相結(jié)合的一種技術(shù)，其首先是進(jìn)行PCR，然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性分析，結(jié)果是以RFLP圖譜的形式表現(xiàn)出來。通常情況下應(yīng)用PCR-RFLP能夠?qū)⒓?xì)菌鑒定到種甚至是亞種，少數(shù)細(xì)菌可鑒定到屬。 本研究以細(xì)菌的16s rDNA為研究目標(biāo)，采用PCR-RFLP技術(shù)，對兔皮中分離到的6種細(xì)菌在分子水平上進(jìn)行鑒定，以期開發(fā)出一種準(zhǔn)確、快速的檢測方法。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 甘肅省是我國皮毛進(jìn)出口貿(mào)易大省，但動物皮毛中含有的大量致病菌會對從事皮毛加工人員的身體健康構(gòu)成了很大威脅，而且如果進(jìn)境皮毛帶有致病菌，也會通過感染對我省人畜造成極大影響。為了盡量降低皮毛中細(xì)菌對加工人員和我省人畜造成的傷害，就要對動物皮毛進(jìn)行一種快速檢測，檢查其是否帶有致病菌，以保證人畜安全。本研究以此為出發(fā)點，希望能找出一種快速有效的檢測方法，從而為這種方法投入使用提供切實可行的理論依據(jù)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨特之處
- PCR-RFLP是將PCR方法與RFLP方法相結(jié)合的一種技術(shù)，通常情況下應(yīng)用PCR-RFLP能夠?qū)⒓?xì)菌鑒定到種甚至是亞種，少數(shù)細(xì)菌可鑒定到屬。本研究以細(xì)菌的16s rDNA為研究目標(biāo)，采用PCR-RFLP技術(shù)，對兔皮中分離到的6種細(xì)菌在分子水平上進(jìn)行鑒定，以期開發(fā)出一種準(zhǔn)確、快速的檢測動物皮毛中致病菌的方法，能對皮毛快速檢測方法的開發(fā)提供理論依據(jù)。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 我省的動物皮毛貿(mào)易近幾年在全國迅速發(fā)展，尤其是皮毛進(jìn)出口貿(mào)易取得了快速進(jìn)步。但動物皮毛中一旦檢出致病菌，就要進(jìn)行焚燒等處理，不僅造成經(jīng)濟(jì)上的損失，而且一旦感染人畜，造成的影響是不能估計的。 如果能找出一種快速有效檢測致病菌的方法，并將其開發(fā)成試劑盒，對于質(zhì)量監(jiān)察檢驗部門和出入境檢驗檢疫部門來說將極大地減輕他們用老方法檢驗的工作量，而且將對人畜傷害降到最低。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 對分離自進(jìn)口兔皮中的6種細(xì)菌，即莫拉菌屬、肺炎克雷伯菌、皮氏羅爾斯頓菌、產(chǎn)色葡萄球菌、睪丸酮叢毛單胞菌、嗜銅菌屬，分別進(jìn)行基因組DNA提取，然后以所提取的DNA為模版，用16s rDNA的通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增。6種菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以17種內(nèi)切酶，即AvaI、BamHI、BgⅡ、DraI、EcoRI、EcoRⅡ、HindⅢ、Hinf、HpaI、PstI、SmaI、TaqI、XbaI、XmaI、AluI、XhoI、PvuI進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，每種細(xì)菌都形成了種特異的16s rDNA RFLP指紋。結(jié)果表明該方法是一種快速、可靠的細(xì)菌分析、鑒定方法，可應(yīng)用于這6種菌的鑒定。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 經(jīng)鑒定，該論文研究處于目前國內(nèi)外相關(guān)研究前列，且對我省皮毛進(jìn)出口貿(mào)易有很重要的意義，同意推薦。
參考文獻(xiàn)
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同類課題研究水平概述
- 傳統(tǒng)的微生物分類鑒定是依賴純培養(yǎng)分離方法，通過表型特征和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，對其生理生化反應(yīng)和細(xì)胞組成成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析來鑒定。但自然環(huán)境中有相當(dāng)多的菌種用純培養(yǎng)方法無法培養(yǎng)出來。而且純培養(yǎng)分離方法使用配比簡單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差更使得可培養(yǎng)的種類大大減少。 16S rDNA是編碼16S rRNA的基因，在細(xì)菌的16S rDNA中有多個區(qū)段高度保守，根據(jù)這些保守區(qū)人們可以設(shè)計出細(xì)菌的通用引物，可以用來擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16S rDNA片段，并且這些引物僅對細(xì)菌是特異性的，也就是說這些引物不會與非細(xì)菌的DNA互補，而細(xì)菌的16S rDNA可變區(qū)的差異可以用來區(qū)分不同的菌。因此，16S rDNA可以作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。 在分類鑒定一些特殊環(huán)境下的微生物時，由于分離培養(yǎng)技術(shù)的限制，難以獲得它們的純培養(yǎng)進(jìn)行生理生化學(xué)等指標(biāo)的分析，這樣16S rDNA序列分析技術(shù)的優(yōu)越性就體現(xiàn)出來了。 PCR-RELP是根據(jù)16S rRNA基因的保守區(qū)設(shè)計通用引物，其中一個引物5’端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，提取待分析樣品的總DNA，以它為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR產(chǎn)物一端就帶有這種熒光標(biāo)記，然后將PCR產(chǎn)物用合適的限制性內(nèi)切酶消化。由于在不同細(xì)菌的擴(kuò)增片段內(nèi)存在核苷酸序列的差異，酶切位點就會存在差異，酶切后就會產(chǎn)生許多不同長度的限制性片段。消化產(chǎn)物用自動測序儀進(jìn)行檢測，只有末端帶熒光標(biāo)記的片段能被檢測到，而其他沒有帶熒光標(biāo)記的片段則檢測不到。這些末端標(biāo)記的片段就可以反映微生物群落組成情況，因為不同長度的末端限制性片段必然代表不同的細(xì)菌，也就是說一種末端限制性片段至少代表一種細(xì)菌。 目前國內(nèi)外單獨對16S rDNA 或RFLP這兩種理論技術(shù)分開研究雖然較多，但將它們結(jié)合在一起進(jìn)行16S rDNA PCR-RFLP指紋圖譜的研究僅查到幾篇報道，并且都是對土壤和乳制品中的微生物進(jìn)行分離檢測。目前國內(nèi)外對于運用16S rDNA PCR-RFLP指紋圖譜分析方法進(jìn)行動物皮毛中致病菌的研究還無人問津。因此，我們首次將這種技術(shù)應(yīng)用到動物皮毛致病菌的研究中，希望能為快速檢測動物皮毛中的致病菌提供理論依據(jù)，并因此為切入點開發(fā)出快速檢測試劑盒，來取代現(xiàn)在傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法。
