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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 兔皮中6種條件性致病菌16s rDNA PCR-RFLP指紋圖譜分析方法的研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 動(dòng)物皮毛中含有大量細(xì)菌，有一部分細(xì)菌為人畜共患，對(duì)從事皮毛加工人員的身體健康構(gòu)成了很大威脅。16S rDNA是細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最常用的分子鐘，種類少、含量大、分子大小適中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域。本研究以此為指導(dǎo)，以細(xì)菌的16s rDNA為研究目標(biāo)，采用PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)兔皮中分離到的6種細(xì)菌在分子水平上進(jìn)行鑒定，以期開(kāi)發(fā)出一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法。
- 詳細(xì)介紹：
- 動(dòng)物皮毛中含有大量的細(xì)菌，多數(shù)情況下為非致病菌，但也有一部分細(xì)菌為人畜共患。這些有害細(xì)菌的存在對(duì)于從事皮毛加工人員的身體健康構(gòu)成了很大的威脅。 16S rDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中最常用的分子鐘，其種類少，含量大（約占細(xì)菌RNA含量的80％），分子大小適中。16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性。然而在16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域。根據(jù)各種細(xì)菌的16S rDNA可變區(qū)進(jìn)行細(xì)菌鑒定已應(yīng)用到各領(lǐng)域的微生物鑒定中。 PCR-RFLP是將PCR方法與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）相結(jié)合的一種技術(shù)，其首先是進(jìn)行PCR，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性分析，結(jié)果是以RFLP圖譜的形式表現(xiàn)出來(lái)。通常情況下應(yīng)用PCR-RFLP能夠?qū)⒓?xì)菌鑒定到種甚至是亞種，少數(shù)細(xì)菌可鑒定到屬。 本研究以細(xì)菌的16s rDNA為研究目標(biāo)，采用PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)兔皮中分離到的6種細(xì)菌在分子水平上進(jìn)行鑒定，以期開(kāi)發(fā)出一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法。
作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 甘肅省是我國(guó)皮毛進(jìn)出口貿(mào)易大省，但動(dòng)物皮毛中含有的大量致病菌會(huì)對(duì)從事皮毛加工人員的身體健康構(gòu)成了很大威脅，而且如果進(jìn)境皮毛帶有致病菌，也會(huì)通過(guò)感染對(duì)我省人畜造成極大影響。為了盡量降低皮毛中細(xì)菌對(duì)加工人員和我省人畜造成的傷害，就要對(duì)動(dòng)物皮毛進(jìn)行一種快速檢測(cè)，檢查其是否帶有致病菌，以保證人畜安全。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，希望能找出一種快速有效的檢測(cè)方法，從而為這種方法投入使用提供切實(shí)可行的理論依據(jù)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- PCR-RFLP是將PCR方法與RFLP方法相結(jié)合的一種技術(shù)，通常情況下應(yīng)用PCR-RFLP能夠?qū)⒓?xì)菌鑒定到種甚至是亞種，少數(shù)細(xì)菌可鑒定到屬。本研究以細(xì)菌的16s rDNA為研究目標(biāo)，采用PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)兔皮中分離到的6種細(xì)菌在分子水平上進(jìn)行鑒定，以期開(kāi)發(fā)出一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)動(dòng)物皮毛中致病菌的方法，能對(duì)皮毛快速檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 我省的動(dòng)物皮毛貿(mào)易近幾年在全國(guó)迅速發(fā)展，尤其是皮毛進(jìn)出口貿(mào)易取得了快速進(jìn)步。但動(dòng)物皮毛中一旦檢出致病菌，就要進(jìn)行焚燒等處理，不僅造成經(jīng)濟(jì)上的損失，而且一旦感染人畜，造成的影響是不能估計(jì)的。 如果能找出一種快速有效檢測(cè)致病菌的方法，并將其開(kāi)發(fā)成試劑盒，對(duì)于質(zhì)量監(jiān)察檢驗(yàn)部門(mén)和出入境檢驗(yàn)檢疫部門(mén)來(lái)說(shuō)將極大地減輕他們用老方法檢驗(yàn)的工作量，而且將對(duì)人畜傷害降到最低。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 對(duì)分離自進(jìn)口兔皮中的6種細(xì)菌，即莫拉菌屬、肺炎克雷伯菌、皮氏羅爾斯頓菌、產(chǎn)色葡萄球菌、睪丸酮叢毛單胞菌、嗜銅菌屬，分別進(jìn)行基因組DNA提取，然后以所提取的DNA為模版，用16s rDNA的通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增。6種菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以17種內(nèi)切酶，即AvaI、BamHI、BgⅡ、DraI、EcoRI、EcoRⅡ、HindⅢ、Hinf、HpaI、PstI、SmaI、TaqI、XbaI、XmaI、AluI、XhoI、PvuI進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，每種細(xì)菌都形成了種特異的16s rDNA RFLP指紋。結(jié)果表明該方法是一種快速、可靠的細(xì)菌分析、鑒定方法，可應(yīng)用于這6種菌的鑒定。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 經(jīng)鑒定，該論文研究處于目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究前列，且對(duì)我省皮毛進(jìn)出口貿(mào)易有很重要的意義，同意推薦。
參考文獻(xiàn)
- [1] Chinnaswamy,et al. Genetic diversity of native Bradyrhizobia isolated from soybeans(Glycine max L.) in different agricultural- ecological-climate regions of India[J]. Applied and environmental microbiology, 2008,1. [2] Hector Toledo,et al. Tetracycline resistance in Chilean clinical isolates of Helicobacter pylori. J. Antimicrob. Chemother., Mar 2010, 65. [3] Christian Michel,et al. Diversity of lactic acid bacteria associated with fish and the fish farm environment, established by amplified rRNA gene restriction analysis. Applied and environmental microbiology,2007, 73(9). [4] Ya-Sung Yang,et al. Recurrent Klebsiella pneumoniae Liver Abscess: Clinical and Microbiological Characteristics. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 2009, 47(10). [5] Joyce, et al. Pyogenic Liver Abscesses Caused by Klebsiella pneumoniae: US Appearance and Aspiration Findings. Radiology, 2007, 242(3).
同類課題研究水平概述
- 傳統(tǒng)的微生物分類鑒定是依賴純培養(yǎng)分離方法，通過(guò)表型特征和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，對(duì)其生理生化反應(yīng)和細(xì)胞組成成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析來(lái)鑒定。但自然環(huán)境中有相當(dāng)多的菌種用純培養(yǎng)方法無(wú)法培養(yǎng)出來(lái)。而且純培養(yǎng)分離方法使用配比簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差更使得可培養(yǎng)的種類大大減少。 16S rDNA是編碼16S rRNA的基因，在細(xì)菌的16S rDNA中有多個(gè)區(qū)段高度保守，根據(jù)這些保守區(qū)人們可以設(shè)計(jì)出細(xì)菌的通用引物，可以用來(lái)擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16S rDNA片段，并且這些引物僅對(duì)細(xì)菌是特異性的，也就是說(shuō)這些引物不會(huì)與非細(xì)菌的DNA互補(bǔ)，而細(xì)菌的16S rDNA可變區(qū)的差異可以用來(lái)區(qū)分不同的菌。因此，16S rDNA可以作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。 在分類鑒定一些特殊環(huán)境下的微生物時(shí)，由于分離培養(yǎng)技術(shù)的限制，難以獲得它們的純培養(yǎng)進(jìn)行生理生化學(xué)等指標(biāo)的分析，這樣16S rDNA序列分析技術(shù)的優(yōu)越性就體現(xiàn)出來(lái)了。 PCR-RELP是根據(jù)16S rRNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物5’端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，提取待分析樣品的總DNA，以它為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR產(chǎn)物一端就帶有這種熒光標(biāo)記，然后將PCR產(chǎn)物用合適的限制性內(nèi)切酶消化。由于在不同細(xì)菌的擴(kuò)增片段內(nèi)存在核苷酸序列的差異，酶切位點(diǎn)就會(huì)存在差異，酶切后就會(huì)產(chǎn)生許多不同長(zhǎng)度的限制性片段。消化產(chǎn)物用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，只有末端帶熒光標(biāo)記的片段能被檢測(cè)到，而其他沒(méi)有帶熒光標(biāo)記的片段則檢測(cè)不到。這些末端標(biāo)記的片段就可以反映微生物群落組成情況，因?yàn)椴煌L(zhǎng)度的末端限制性片段必然代表不同的細(xì)菌，也就是說(shuō)一種末端限制性片段至少代表一種細(xì)菌。 目前國(guó)內(nèi)外單獨(dú)對(duì)16S rDNA 或RFLP這兩種理論技術(shù)分開(kāi)研究雖然較多，但將它們結(jié)合在一起進(jìn)行16S rDNA PCR-RFLP指紋圖譜的研究?jī)H查到幾篇報(bào)道，并且都是對(duì)土壤和乳制品中的微生物進(jìn)行分離檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于運(yùn)用16S rDNA PCR-RFLP指紋圖譜分析方法進(jìn)行動(dòng)物皮毛中致病菌的研究還無(wú)人問(wèn)津。因此，我們首次將這種技術(shù)應(yīng)用到動(dòng)物皮毛致病菌的研究中，希望能為快速檢測(cè)動(dòng)物皮毛中的致病菌提供理論依據(jù)，并因此為切入點(diǎn)開(kāi)發(fā)出快速檢測(cè)試劑盒，來(lái)取代現(xiàn)在傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)方法。
