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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 商陸提取物抑菌活性評(píng)價(jià)研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本作品采用不同方法提取商陸活性成分，研究這些提取物的體外抑菌活性。首先采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定不同的商陸提取物對(duì)臨床常見(jiàn)的15 株病原菌的抑菌圈，篩選出有用的病原菌（商陸對(duì)其有抑制效果），再采用液體稀釋法對(duì)上述病原菌進(jìn)行最小抑菌濃度的測(cè)定，并重復(fù)多次。其目的在于探討商陸的有效抑菌活性成分，為商陸的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為商陸的用量提供參考。
- 詳細(xì)介紹：
- 我們用不同方法提取商陸活性成分，研究這些提取物的體外抑菌活性。首先采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定不同的商陸提取物對(duì)臨床常見(jiàn)的15 株病原菌的抑菌圈，篩選出有用的病原菌（商陸對(duì)其有抑制效果），再采用液體稀釋法對(duì)上述病原菌進(jìn)行最小抑菌濃度的測(cè)定，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)源于商陸的植物殺菌藥物奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，也為商陸的用量提供參考。我們采用不同的方法對(duì)商陸不同提取物的抑菌程度進(jìn)行測(cè)定，并重復(fù)多次，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。 1 材料 1.1 商陸飲片：購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠。 1.2 供試病原菌： 金黃色葡萄球菌（25923）、大腸埃希菌（25922）、銅綠假單胞菌（27853）由本室保存。產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、志賀菌、腸球菌、甲型副傷寒菌、乙型副傷寒菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、白假絲酵母和新生隱球菌由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供。 1.3 試劑和儀器： D101大孔樹(shù)脂（上海摩速科學(xué)器材有限公司，20091010）；正丁醇（浙江杭州雙林化工試劑廠，20090212，分析純）；香草醛（上海雙香助劑廠，20090718，分析純）；濃硫酸（中國(guó)杭州化學(xué)試劑有限公司，20081109，分析純）；薄層硅膠G（青島海洋化工有限公司，20090103，分析純）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司，R-201）；精密電子天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司，AR520）；普通冰箱（海爾集團(tuán)，BCD-205E/Y）；手提式壓力蒸汽滅菌器（上海醫(yī)用核子儀器廠，YXQ.SG4.280型）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9070A型）。 1.4 培養(yǎng)基： MH培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%。 沙氏培養(yǎng)基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，瓊脂2%。 2 方法 2.1 商陸不同提取物的制備： 2.1.1商陸水煎液：稱取商陸飲片100 g，加蒸餾水煮沸提取3次，每次1 h，液料比為10:1。合并提取液，干凈紗布過(guò)濾，濾液濃縮至100 ml，即每1 ml含生藥1 g，4℃保存，備用。 2.1.2 商陸粗多糖提取物：稱取商陸飲片100 g，粉碎后加蒸餾水80℃水浴提取3次，每次2 h，液料比為10:1。合并提取液，干凈紗布過(guò)濾，濾液濃縮至一定體積后加入等體積5%三氯乙酸，充分混勻后離心去除蛋白質(zhì)沉淀，上清液濃縮至一定體積，緩慢加入95%乙醇制備成乙醇終濃度為80%的溶液，4℃靜置8 h，4000 rpm離心15 min，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3次，60℃烘干，備用。 2.1.3 商陸粗總皂苷提取物：稱取商陸飲片100 g，加60%乙醇回流提取3次，每次2 h，液料比為10:1。合并提取液，干凈紗布過(guò)濾，濾液濃縮至一定體積后用水飽和正丁醇反復(fù)萃取，合并正丁醇層，減壓蒸餾濃縮，60℃烘干,備用。 2.1.4 不同極性商陸皂苷提取物：稱取商陸飲片100 g，加60%乙醇回流提取3次，每次2 h，液料比為10:1。合并提取液，干凈紗布過(guò)濾，濾液濃縮至一定體積，用D101大孔樹(shù)脂吸附過(guò)夜，裝柱。先用蒸餾水將吸附在樹(shù)脂上的糖洗脫干凈，然后分別用30%、60%、90%乙醇溶液各2000 ml梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮至一定體積，用水飽和正丁醇充分萃取，減壓蒸餾濃縮，60℃烘干備用。 2.2 商陸不同提取物的鑒定 2.2.1 商陸粗多糖定性鑒別：取干燥的粗多糖0.1 g加2 ml蒸餾水溶解，加入含15%α-萘酚的乙醇溶液2 ml，充分混勻，沿試管壁緩緩加入0.5 ml濃硫酸，液層交界處如出現(xiàn)紫色環(huán)，說(shuō)明化合物為糖類。 2.2.2 商陸粗皂苷定性鑒別：茚三酮試劑反應(yīng)呈陰性，基本排除蛋白、多肽或氨基酸類物質(zhì)；醋酐-濃硫酸顯色反應(yīng)呈紅棕色；在以羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑的硅膠G薄層板上以氯仿-甲醇-水(7:3:0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴香草醛-濃硫酸，105℃烘烤2 min，出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)，說(shuō)明化合物為皂苷類。 2.3 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈： 2.3.1 將在56℃左右恒溫的無(wú)菌MH瓊脂傾注于直徑為90mm的平板中，使瓊脂的厚度為4mm（大約25ml） 2.3.2 菌株活化后，新鮮的菌株用無(wú)菌水校正至0.5麥?zhǔn)媳葷釂挝唬ㄏ喈?dāng)于1.5*108cfu/ml），作為供試菌液。 2.3.3 用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。棉簽在三個(gè)方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60度）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。 2.3.4 用記號(hào)筆在平板底部將平板劃分成四等分，然后用直徑6 mm打孔器在每份中央打孔，去除孔內(nèi)瓊脂。 2.3.5 蓋上平板的蓋子，放置3-10分鐘。各提取物樣品用少量無(wú)菌水或二甲基亞砜溶解后加于孔中，以滿而不溢為宜并作好標(biāo)記，同時(shí)以MH肉湯作為陰性對(duì)照。37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察有無(wú)抑菌圈。 2.4 微量液體稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）： 2.4.1 菌株活化后，采用剛剛培養(yǎng)18-24h的菌株，用無(wú)菌水校正至0.5麥?zhǔn)媳葷釂挝?，然?:200稀釋，使菌液濃度為105 cfu/ml。 2.4.2 各提取物樣品用無(wú)菌水或二甲基亞砜溶解后，用MH液體培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)倍稀釋。 2.4.3 在微量聚乙烯孔板中加入各種不同濃度的樣品100 ?l，并接種100 ?l稀釋好的各菌液，同時(shí)設(shè)立菌液對(duì)照和樣品對(duì)照，做好標(biāo)記，蓋上蓋板。 2.4.4 37℃培養(yǎng)24 h，觀察各孔中培養(yǎng)液的濁度，將孔底部不出現(xiàn)細(xì)菌沉淀的最低濃度作為該樣品對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度。 2.4.5 將培養(yǎng)24h后的微量聚乙烯孔板中的每孔液體分別接種于無(wú)菌MH瓊脂培養(yǎng)基上，蓋上平板蓋，37℃培養(yǎng)24h，觀察液體里細(xì)菌生長(zhǎng)情況。 2.4.6 將肉眼觀察結(jié)果與接種于MH瓊脂培養(yǎng)基的液體里細(xì)菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行比較，得出最后的結(jié)論（以后者的結(jié)果為主）。 3 結(jié)果 3.1 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈： 用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定不同商陸提取物對(duì)15種常見(jiàn)病原細(xì)菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，商陸水煎液對(duì)不動(dòng)桿菌、白假絲酵母、新生隱球菌有抑菌活性；商陸粗多糖對(duì)產(chǎn)氣桿菌、志賀菌有抑菌活性；商陸粗總皂苷對(duì)不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門菌、志賀菌、枯草芽孢桿菌、新生隱球菌有抑菌活性；商陸皂苷30%乙醇提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、志賀菌、甲型副傷寒菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、白假絲酵母都有抑菌作用；商陸皂苷60%和90%乙醇提取物對(duì)供試菌株無(wú)明顯抑菌活性。 3.2 微量液體稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)： 用微量液體稀釋法測(cè)定具有抑菌活性樣品的MIC值，商陸水煎液對(duì)新生隱球菌的MIC為62.5 mg/ml，對(duì)不動(dòng)桿菌和白假絲酵母的MIC為500.0 mg/ml；商陸粗多糖對(duì)志賀菌的MIC為7.5 mg/ml，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC為60.0 mg/ml；商陸粗總皂苷對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為4.5 mg/ml，對(duì)銅綠假單胞菌和新生隱球菌的MIC為9.0 mg/ml，對(duì)志賀菌的MIC為18.0 mg/ml，對(duì)不動(dòng)桿菌和傷寒沙門菌的MIC為36.0 mg/ml；商陸皂苷30%乙醇提取物抗菌譜最廣，對(duì)大腸埃希菌、不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、志賀菌、枯草芽孢桿菌的MIC值為17.6 mg/ml，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、甲型副傷寒菌、普通變形桿菌的MIC值均為35.3 mg/ml，對(duì)白假絲酵母的MIC值為70.0 mg/ml。
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作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 目的：本作品研究植物商路的不同提取物的體外抑菌作用，探討商陸的有效抑菌活性成分，為商陸的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。 基本思路：我們用不同方法提取商陸活性成分，研究這些提取物的體外抑菌活性。首先采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定不同的商陸提取物對(duì)臨床常見(jiàn)的15 株病原菌的抑菌圈，篩選出有用的病原菌（商陸對(duì)其有抑制效果），再采用液體稀釋法對(duì)上述病原菌進(jìn)行最小抑菌濃度的測(cè)定，并重復(fù)多次。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 濫用抗生素加快了耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，尤其是“超級(jí)細(xì)菌”耐藥譜廣泛，尋找新的抗菌藥物迫在眉睫。而抗菌中藥的最大優(yōu)點(diǎn)是不易產(chǎn)生耐藥性。探索抗菌中草藥，進(jìn)行深入的研究其抑菌成分，有望研制新一代抗菌制劑，為耐藥細(xì)菌的治療提供新的方向。 我們采用不同的方法對(duì)商陸不同提取物進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)商陸的主要成分皂苷的抑菌效果較明顯。研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)源于商陸的植物殺菌藥物奠定了基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 研究發(fā)現(xiàn)商陸對(duì)許多病原細(xì)菌和真菌有抑制生長(zhǎng)的作用，可以開(kāi)發(fā)成抗菌藥物。再者，商陸的制作工藝比抗生素要簡(jiǎn)單，副作用低，可以增強(qiáng)免疫力，聯(lián)合抗生素使用可以消除抗生素的不良反應(yīng)。深入研究有望研制源于商陸的植物殺菌藥物，發(fā)展前景可觀，具有良好的經(jīng)濟(jì)前景和社會(huì)價(jià)值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：探討商陸的有效抑菌活性成分。 方法：采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定不同商陸提取物對(duì)臨床常見(jiàn)的15株病原菌的抑菌圈；采用液體稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度。 結(jié)果：商陸不同粗提物對(duì)病原菌有不同程度的抑制作用，商陸水煎液僅對(duì)不動(dòng)桿菌、白假絲酵母、新生隱球菌有一定抑制作用，最小抑菌濃度分別為500.0 mg/ml、500.0 mg/ml和62.5 mg/ml，抑菌作用不明顯；多糖提取物僅對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、痢疾志賀菌有一定抑制作用，最小抑菌濃度為60.0 mg/ml和7.5 mg/ml；商陸皂苷30%乙醇提取物抑菌效果較明顯、抗菌譜較廣，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、志賀菌、甲型副傷寒菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、白假絲酵母均有抑菌作用，最小抑菌濃度范圍為17.6 mg/ml～70.0 mg/ml；商陸皂苷60%和90%乙醇提取物無(wú)抑菌活性。結(jié)論：商陸抑菌活性主要有效部位為極性較大的皂苷類提取物。
獲獎(jiǎng)情況
- 向《中國(guó)現(xiàn)代中藥》投稿，已修回，擬錄用。
鑒定結(jié)果
- 已通過(guò)審核
參考文獻(xiàn)
- 1.楊幫,丁偉,趙志模,等.美洲商陸和姜黃提取物抑菌活性的研究J.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)[J].2005,27(3): 297-304． 2.張巧艷，鄭漢臣,易楊華,等.商陸屬植物皂苷類成分及其藥理活性.國(guó)外醫(yī)藥（植物藥分冊(cè)）.2000,15(3):104—107 3.劉爽,楊愛(ài)國(guó),趙琦,等.美洲商陸抗真菌蛋白轉(zhuǎn)化玉米的研究和抗病性檢測(cè).玉米科學(xué).2007,15(2): 31～35,38 4.陳國(guó)菊,雷建軍,曹必好.商陸抗病毒蛋白在植物抗病上的應(yīng)用.長(zhǎng)江茲菜（學(xué)術(shù)版）.2009,（20）：5－8 5.吳決,顧世海,王立霞.抗茵性中藥藥物敏感試驗(yàn)方法研究.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).2000,1(6):489-491 6. 何明張,永跟.中藥抑菌作用研究現(xiàn)狀.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)(中醫(yī)臨床版).2007,14(6):44-46 7.黃秀鳳.中藥提取物及其化學(xué)成分抑菌作用的研究進(jìn)展.中國(guó)藥物與臨床.2007,7(5):370-371
同類課題研究水平概述
- 從1948年Kassanis等從商陸中提取得到一種抗病毒的糖蛋白后，商陸中的抑菌化學(xué)成分逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[1] 。隨后，在1997年，Zoubenko O[2]等在研究商陸抗病毒蛋白（PAP）時(shí)，發(fā)現(xiàn) PAP除了抗植物病毒和動(dòng)物病毒活性以外，還對(duì)真菌和細(xì)菌的活性有一定的抑制作用。 在2003年，賈金萍[1]等人在山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)上發(fā)表了商陸多種提取物對(duì)病菌的抑菌效果。緊接著，在2005年，楊幫[3]等對(duì)美洲商陸的多種溶劑提取物進(jìn)行真菌的抑制實(shí)驗(yàn)，證明了其甲醇提取物對(duì)柑橘綠霉和小麥紋枯2種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用。 從20世紀(jì)40年代，我國(guó)就開(kāi)始進(jìn)行傳統(tǒng)中藥的體外抑菌實(shí)驗(yàn)，證明了一大批中藥對(duì)各種細(xì)菌有抑制作用。1998年，杜渝平[4]等對(duì)黃連等多種中藥進(jìn)行體外抑菌活性研究，發(fā)現(xiàn)能夠抑菌的單味中藥有很多，且能夠抑制多種菌屬。隨后，在2002年，溫燕[5]等進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)研究，表明魚(yú)腥草具有抗菌、消炎、解熱止咳作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎球菌等具有明顯抑制作用，且能增強(qiáng)血白細(xì)胞的吞噬能力，收到了較好的臨床療效。 參考文獻(xiàn)： [1]賈金萍,秦雪梅,李青山．商陸化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)[J] ．2003,34(1): 89-92． [2] Zoubenko O, Uckun F, Hur Y, et al. Plant resistanceto fungal infection induced by nontoxic pokeweed antiviral protein mutants [J]. Nature Biotechnology, 1997,15 (10):992-996. [3]楊幫,丁偉,趙志模,等.美洲商陸和姜黃提取物抑菌活性的研究J.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)[J].2005,27(3): 297-304． [4] 杜渝平，盧仙娥，鄧濟(jì)更等. 醫(yī)院感染菌的抗生素與抗菌中藥敏感性的對(duì)比研究.重慶醫(yī)學(xué)，1998,27(1):33-34 [5] 溫燕, 劉文輝. 魚(yú)腥草注射液治療肺部感染48例[J]. 新中醫(yī), 2002, 34( 7) : 65
