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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 生物冶金微生物與重金屬生物處理微生物基因工程改造及相關(guān)機(jī)理研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 喜溫硫桿菌是生物冶金主要的硫氧化細(xì)菌之一。本研究團(tuán)隊(duì)利用細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)移方法實(shí)現(xiàn)了外源基因?qū)υ摼霓D(zhuǎn)移操作，之后針對(duì)該菌又建立了更為便捷高效的外源基因電轉(zhuǎn)方法，對(duì)喜溫硫桿菌進(jìn)行基因改造，提高其生長(zhǎng)和氧化速度。 有色金屬礦經(jīng)常含有較多的重金屬元素。金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸的低分子量金屬結(jié)合蛋白。我們合成了金屬硫蛋白基因，把它轉(zhuǎn)入大腸桿菌，構(gòu)建了對(duì)重金屬有強(qiáng)親和力的基因工程菌，取得了很好的效果。
- 詳細(xì)介紹：
- 生物冶金的主要缺點(diǎn)是菌的氧化速度慢，生長(zhǎng)慢，礦物處理時(shí)間長(zhǎng)。利用基因工程的方法改造浸礦菌的氧化代謝途徑，提高菌種的礦物氧化速率和生長(zhǎng)速率，才能從根本上解決生物冶金效率低的問(wèn)題。生物冶金過(guò)程中，細(xì)菌對(duì)鐵和硫的生物氧化是與金屬浸出最直接相關(guān)的生化反應(yīng)過(guò)程。 喜溫硫桿菌（Acidithiobacillus caldus）是生物冶金主要的硫氧化細(xì)菌之一。該菌是極端適酸性自養(yǎng)微生物，最適生長(zhǎng)pH 2左右，在pH低于1的條件下仍能很好地生長(zhǎng)；該菌不利用有機(jī)物，通過(guò)氧化單質(zhì)硫或硫化物獲得能量并固定二氧化碳進(jìn)行生長(zhǎng)。該菌具有獨(dú)特的生理特性，目前常規(guī)的基因轉(zhuǎn)移方法均無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)該菌的基因操作。本研究團(tuán)隊(duì)利用細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)移方法率先在國(guó)際上實(shí)現(xiàn)了外源基因?qū)υ摼霓D(zhuǎn)移操作，之后針對(duì)該菌又建立了更為便捷高效的外源基因電轉(zhuǎn)方法，是國(guó)際上唯一成功對(duì)該菌進(jìn)行遺傳改造的研究團(tuán)隊(duì)。本研究將利用電轉(zhuǎn)方法對(duì)喜溫硫桿菌進(jìn)行基因改造，提高其生長(zhǎng)和氧化速度。 嗜鐵鉤端螺旋菌（Leptospirillum ferriphilum）是生物冶金過(guò)程中重要的鐵氧化菌。該菌也是極端適酸性自養(yǎng)微生物。該菌通過(guò)氧化亞鐵離子（Fe2+）獲得能量并固定二氧化碳進(jìn)行生長(zhǎng)。鐵氧化細(xì)菌和硫氧化細(xì)菌相互配合才能使生物冶金過(guò)程高效進(jìn)行?，F(xiàn)在認(rèn)為生物冶金過(guò)程包括直接氧化和間接氧化機(jī)理。直接氧化是微生物吸附到礦石表面直接氧化礦石，從礦石上得到電子；而間接氧化是指溶液中的高價(jià)離子氧化礦物變成低價(jià)離子，而微生物的氧化作用是使這些低價(jià)離子再生為高價(jià)離子使氧化反應(yīng)不斷進(jìn)行。直接氧化離不開(kāi)微生物對(duì)礦石的吸附，而目前對(duì)于這方面的研究還不夠細(xì)致，大多使用單菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與實(shí)際生產(chǎn)狀態(tài)有很大差別；少數(shù)實(shí)驗(yàn)使用混合菌，但只知道混合菌的總數(shù)，無(wú)法獲得兩種菌的比例。為此，本研究將利用分子生物學(xué)的定量PCR技術(shù)，確定兩種菌的吸附比例并建立相應(yīng)的吸附模型。 有色金屬礦經(jīng)常含有較多的重金屬元素。近年來(lái)，隨著我國(guó)優(yōu)質(zhì)礦石的不斷減少、枯竭，不得不開(kāi)發(fā)利用難冶礦。以金礦為例，含砷（As）和黃鐵礦的金礦石在我國(guó)占有很大比例。砷具有很大的毒性，俗稱砒霜的成分就是三氧化二砷。傳統(tǒng)火冶方法會(huì)使砷變?yōu)檎舭l(fā)進(jìn)入空氣，導(dǎo)致工人嚴(yán)重中毒并污染大氣。國(guó)家已經(jīng)明文規(guī)定高含砷金礦不能采用火冶的傳統(tǒng)冶金工藝。采用生物冶金工藝，砷變?yōu)殡x子進(jìn)入溶液，經(jīng)過(guò)沉淀、吸附等處理可以去除液體中的砷，使廢水達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于高重金屬濃度廢水可以采用化學(xué)沉淀法。由于重金屬的危害性極大，國(guó)家建立了嚴(yán)格的排放標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于含低濃度重金屬?gòu)U水，加入大量化學(xué)試劑后，化學(xué)試劑本身就構(gòu)成了污染，并且也不經(jīng)濟(jì)。采用生物吸附法能夠避免化學(xué)試劑污染，是可行的方法。然而，由于存在吸附平衡，在重金屬濃度很低的情況下，如果吸附劑對(duì)重金屬的親和性不夠高，多數(shù)重金屬離子就不會(huì)被吸附。金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸的低分子量金屬結(jié)合蛋白。我們合成了金屬硫蛋白基因，把它轉(zhuǎn)入大腸桿菌（E. coli），構(gòu)建了對(duì)重金屬有強(qiáng)親和力的基因工程菌，取得了很好的效果。為了提高金屬硫蛋白在重組大腸桿菌中的表達(dá)量，我們將多個(gè)金屬硫蛋白基因串聯(lián)起來(lái)進(jìn)行表達(dá)，亦取得了理想的結(jié)果。為了能夠監(jiān)測(cè)金屬硫蛋白的表達(dá)，我們將紅色熒光蛋白與金屬硫蛋白串聯(lián)表達(dá)，使表達(dá)金屬硫蛋白基因的重組大大腸桿菌變?yōu)榧t色。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 金屬硫蛋白對(duì)重金屬有很高的親和性，在生物體內(nèi)發(fā)揮重金屬解毒等多種生理功能。把金屬硫蛋白基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，可以有效解決生物冶金效率低的問(wèn)題。我們利用基因改造技術(shù)，對(duì)浸礦微生物進(jìn)行了遺傳改造，促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)和代謝活性；研究了混合浸礦微生物對(duì)礦物的吸附機(jī)理，提出了新的吸附模型用于指導(dǎo)生物冶金工藝優(yōu)化；最后，構(gòu)建了對(duì)重金屬具有高親和力的表達(dá)金屬硫蛋白的大腸桿菌，作為冶金廢水重金屬的高效生物吸附劑。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本研究團(tuán)隊(duì)利用細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)移方法率先在國(guó)際上實(shí)現(xiàn)了外源基因?qū)ο矞亓驐U菌的轉(zhuǎn)移操作，建立了外源基因電轉(zhuǎn)方法，提高其生長(zhǎng)和氧化速度。 利用分子生物學(xué)手段，建立了新的微生物吸附模型，可用于指導(dǎo)生物浸出工藝設(shè)計(jì)、工藝條件優(yōu)化以及工藝技術(shù)放大。 成功構(gòu)建了金屬硫蛋白串聯(lián)表達(dá)載體，提高了金屬硫蛋白的表達(dá)效率以及工程菌對(duì)重金屬As(III)等的吸附能力；引入紅色熒光蛋白對(duì)金屬硫蛋白的表達(dá)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了生長(zhǎng)代謝更旺盛的浸礦菌株，有助于提高浸礦活性，縮短浸礦周期，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。 提出混合浸礦微生物競(jìng)爭(zhēng)吸附模型，可用于指導(dǎo)生物冶金工藝優(yōu)化、工藝設(shè)計(jì)。 構(gòu)建了高效串聯(lián)表達(dá)金屬硫蛋白基因的質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建了重金屬高親和力生物吸附劑，可以高效率地去除水中低濃度的重金屬。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 嗜鐵鉤端螺旋菌與喜溫硫桿菌是生物冶金過(guò)程中鐵和硫氧化的重要嗜酸性細(xì)菌。本研究中，我們報(bào)道了嗜鐵鉤端螺旋菌LF-104與喜溫硫桿菌MTH-04二元混合菌群對(duì)黃鐵礦表面的競(jìng)爭(zhēng)吸附。研究結(jié)果表明，嗜鐵鉤端螺旋菌的吸附未受喜溫硫桿菌的影響，但喜溫硫桿菌的吸附卻受嗜鐵鉤端螺旋菌的嚴(yán)重影響；嗜鐵鉤端螺旋菌比喜溫硫桿菌對(duì)黃鐵礦有更高的電作用力?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們提出了競(jìng)爭(zhēng)吸附模型，解釋嗜鐵鉤端螺旋菌與喜溫硫桿菌對(duì)黃鐵礦的競(jìng)爭(zhēng)吸附機(jī)制。上述過(guò)程中嗜鐵鉤端螺旋菌處于主導(dǎo)地位。 金屬硫蛋白（MTs）是一類金屬結(jié)合蛋白。為了吸附重金屬，本文構(gòu)建了表達(dá)人金屬硫蛋白（hMT-A）基因的大腸桿菌。為了增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因與hMT-A基因融合表達(dá)。為了增加金屬硫蛋白表達(dá)效率和金屬結(jié)合容量，分別將兩個(gè)、三個(gè)和四個(gè)金屬硫蛋白基因串聯(lián)連接，并在大腸桿菌中表達(dá)。表達(dá)GST融合三個(gè)串聯(lián)hMT-A基因的重組大腸桿菌表現(xiàn)了最大的鎘（Cd(II)）和砷（As(III)）生物吸附活性，分別達(dá)到 6.36 mg Cd/g dry cell和7.59 mg As/g dry cell。
獲獎(jiǎng)情況
- 1. Ma Y, Lin J, Zhang C, Ren Y, Lin J,Cd(II) and As(III) bioaccumulation by recombinant Escherichia coli expressing oligomeric human metallothioneins, journal of hazardous materials 185 (2011) 1605-1608 (SCI影響因子 4.144) 2. Song J, Lin J, Ren Y, and Lin J, Competitive adsorption of binary mixture of Leptospirillum ferriphilum and Acidithiobacillus caldus onto pyrite, Biotechnology and Bioprocess Engineering 15：923-930 (2010) (SCI影響因子 1.412) 3. Gao L, Ren Y, Lin J, Lin J, 2011, Modeling and simulation of production of metallothionein and red fluorescent fusion protein by recombinant E. coli using graphical programming, in: Labview - Modelling, Programming and Simulations. Intech Press.
鑒定結(jié)果
- 混合浸礦微生物競(jìng)爭(zhēng)吸附模型，可用于指導(dǎo)生物冶金工藝優(yōu)化、工藝設(shè)計(jì)；構(gòu)建了高效串聯(lián)表達(dá)金屬硫蛋白基因的質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建了重金屬高親和力生物吸附劑，可以高效率地去除水中低濃度的重金屬。
參考文獻(xiàn)
- [1] 楊顯萬(wàn)，沈慶峰，郭玉霞, (2003). 難處理金礦的細(xì)菌氧化預(yù)處理. 微生物濕法冶金. pp165-167. [2] 楊洪英，楊立.（2000）.細(xì)菌氧化難浸金礦石的礦物學(xué)研究探討. 有色金屬. 52（1）：86-89.
同類課題研究水平概述
- 極端嗜酸性自養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是本研究團(tuán)隊(duì)利用結(jié)合轉(zhuǎn)移技術(shù)在國(guó)際上率先取得突破的。之后，國(guó)際上又有兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)用同樣方法成功進(jìn)行了同類菌的轉(zhuǎn)基因工作，其中之一是本研究室人員出國(guó)去歐洲做的工作，另一個(gè)是該領(lǐng)域國(guó)際知名專家D.E. Rawlings研究室的工作。2010年，我們用比結(jié)合轉(zhuǎn)移技術(shù)效率更高的電轉(zhuǎn)化技術(shù)實(shí)現(xiàn)了生物冶金微生物喜溫硫桿菌（Acidithiobacillus caldus）的基因轉(zhuǎn)移[1]，繼續(xù)保持了極端嗜酸性自養(yǎng)微生物基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的國(guó)際領(lǐng)先地位。在本研究中，我們利用上述技術(shù)對(duì)喜溫硫桿菌進(jìn)行了遺傳改造，促進(jìn)了該菌的生長(zhǎng)代謝。國(guó)內(nèi)除我們團(tuán)隊(duì)外，在極端嗜酸性自養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)方面沒(méi)有其它報(bào)道。 混合浸礦菌對(duì)礦石的吸附是礦物直接生物氧化機(jī)理的前提。但多數(shù)研究只研究了混合菌總數(shù)變化規(guī)律，沒(méi)有區(qū)分混合菌內(nèi)發(fā)揮不同作用的各菌的比例。本研究利用分子生物學(xué)方法定量研究了混合吸附各菌的數(shù)量，建立了新的吸附模型。 在串聯(lián)表達(dá)金屬硫蛋白基因，構(gòu)建高效、高親和力重金屬生物吸附劑方面，也具有很高的創(chuàng)新性，在環(huán)境科學(xué)頂級(jí)雜志發(fā)表并獲得了審稿人的好評(píng)。 1. Chen L， Lin J，Li B，Lin J，Liu X，2010，Method development for electrotransformation of Acidithiobacillus caldus，J. Microbiol. Biotechnol. 20(1), 39–44.
