基本信息
- 項目名稱：
- 生物冶金微生物與重金屬生物處理微生物基因工程改造及相關機理研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 喜溫硫桿菌是生物冶金主要的硫氧化細菌之一。本研究團隊利用細菌結合轉移方法實現了外源基因對該菌的轉移操作，之后針對該菌又建立了更為便捷高效的外源基因電轉方法，對喜溫硫桿菌進行基因改造，提高其生長和氧化速度。 有色金屬礦經常含有較多的重金屬元素。金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸的低分子量金屬結合蛋白。我們合成了金屬硫蛋白基因，把它轉入大腸桿菌，構建了對重金屬有強親和力的基因工程菌，取得了很好的效果。
- 詳細介紹：
- 生物冶金的主要缺點是菌的氧化速度慢，生長慢，礦物處理時間長。利用基因工程的方法改造浸礦菌的氧化代謝途徑，提高菌種的礦物氧化速率和生長速率，才能從根本上解決生物冶金效率低的問題。生物冶金過程中，細菌對鐵和硫的生物氧化是與金屬浸出最直接相關的生化反應過程。 喜溫硫桿菌（Acidithiobacillus caldus）是生物冶金主要的硫氧化細菌之一。該菌是極端適酸性自養(yǎng)微生物，最適生長pH 2左右，在pH低于1的條件下仍能很好地生長；該菌不利用有機物，通過氧化單質硫或硫化物獲得能量并固定二氧化碳進行生長。該菌具有獨特的生理特性，目前常規(guī)的基因轉移方法均無法實現對該菌的基因操作。本研究團隊利用細菌結合轉移方法率先在國際上實現了外源基因對該菌的轉移操作，之后針對該菌又建立了更為便捷高效的外源基因電轉方法，是國際上唯一成功對該菌進行遺傳改造的研究團隊。本研究將利用電轉方法對喜溫硫桿菌進行基因改造，提高其生長和氧化速度。 嗜鐵鉤端螺旋菌（Leptospirillum ferriphilum）是生物冶金過程中重要的鐵氧化菌。該菌也是極端適酸性自養(yǎng)微生物。該菌通過氧化亞鐵離子（Fe2+）獲得能量并固定二氧化碳進行生長。鐵氧化細菌和硫氧化細菌相互配合才能使生物冶金過程高效進行?，F在認為生物冶金過程包括直接氧化和間接氧化機理。直接氧化是微生物吸附到礦石表面直接氧化礦石，從礦石上得到電子；而間接氧化是指溶液中的高價離子氧化礦物變成低價離子，而微生物的氧化作用是使這些低價離子再生為高價離子使氧化反應不斷進行。直接氧化離不開微生物對礦石的吸附，而目前對于這方面的研究還不夠細致，大多使用單菌進行實驗，與實際生產狀態(tài)有很大差別；少數實驗使用混合菌，但只知道混合菌的總數，無法獲得兩種菌的比例。為此，本研究將利用分子生物學的定量PCR技術，確定兩種菌的吸附比例并建立相應的吸附模型。 有色金屬礦經常含有較多的重金屬元素。近年來，隨著我國優(yōu)質礦石的不斷減少、枯竭，不得不開發(fā)利用難冶礦。以金礦為例，含砷（As）和黃鐵礦的金礦石在我國占有很大比例。砷具有很大的毒性，俗稱砒霜的成分就是三氧化二砷。傳統(tǒng)火冶方法會使砷變?yōu)檎舭l(fā)進入空氣，導致工人嚴重中毒并污染大氣。國家已經明文規(guī)定高含砷金礦不能采用火冶的傳統(tǒng)冶金工藝。采用生物冶金工藝，砷變?yōu)殡x子進入溶液，經過沉淀、吸附等處理可以去除液體中的砷，使廢水達到排放標準。對于高重金屬濃度廢水可以采用化學沉淀法。由于重金屬的危害性極大，國家建立了嚴格的排放標準。對于含低濃度重金屬廢水，加入大量化學試劑后，化學試劑本身就構成了污染，并且也不經濟。采用生物吸附法能夠避免化學試劑污染，是可行的方法。然而，由于存在吸附平衡，在重金屬濃度很低的情況下，如果吸附劑對重金屬的親和性不夠高，多數重金屬離子就不會被吸附。金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸的低分子量金屬結合蛋白。我們合成了金屬硫蛋白基因，把它轉入大腸桿菌（E. coli），構建了對重金屬有強親和力的基因工程菌，取得了很好的效果。為了提高金屬硫蛋白在重組大腸桿菌中的表達量，我們將多個金屬硫蛋白基因串聯起來進行表達，亦取得了理想的結果。為了能夠監(jiān)測金屬硫蛋白的表達，我們將紅色熒光蛋白與金屬硫蛋白串聯表達，使表達金屬硫蛋白基因的重組大大腸桿菌變?yōu)榧t色。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 金屬硫蛋白對重金屬有很高的親和性，在生物體內發(fā)揮重金屬解毒等多種生理功能。把金屬硫蛋白基因轉入大腸桿菌，可以有效解決生物冶金效率低的問題。我們利用基因改造技術，對浸礦微生物進行了遺傳改造，促進了菌體生長和代謝活性；研究了混合浸礦微生物對礦物的吸附機理，提出了新的吸附模型用于指導生物冶金工藝優(yōu)化；最后，構建了對重金屬具有高親和力的表達金屬硫蛋白的大腸桿菌，作為冶金廢水重金屬的高效生物吸附劑。
科學性、先進性及獨特之處
- 本研究團隊利用細菌結合轉移方法率先在國際上實現了外源基因對喜溫硫桿菌的轉移操作，建立了外源基因電轉方法，提高其生長和氧化速度。 利用分子生物學手段，建立了新的微生物吸附模型，可用于指導生物浸出工藝設計、工藝條件優(yōu)化以及工藝技術放大。 成功構建了金屬硫蛋白串聯表達載體，提高了金屬硫蛋白的表達效率以及工程菌對重金屬As(III)等的吸附能力；引入紅色熒光蛋白對金屬硫蛋白的表達過程進行監(jiān)測。
應用價值和現實意義
- 利用基因工程技術構建了生長代謝更旺盛的浸礦菌株，有助于提高浸礦活性，縮短浸礦周期，提高生產效率，降低生產成本。 提出混合浸礦微生物競爭吸附模型，可用于指導生物冶金工藝優(yōu)化、工藝設計。 構建了高效串聯表達金屬硫蛋白基因的質粒載體，并轉入大腸桿菌構建了重金屬高親和力生物吸附劑，可以高效率地去除水中低濃度的重金屬。
學術論文摘要
- 嗜鐵鉤端螺旋菌與喜溫硫桿菌是生物冶金過程中鐵和硫氧化的重要嗜酸性細菌。本研究中，我們報道了嗜鐵鉤端螺旋菌LF-104與喜溫硫桿菌MTH-04二元混合菌群對黃鐵礦表面的競爭吸附。研究結果表明，嗜鐵鉤端螺旋菌的吸附未受喜溫硫桿菌的影響，但喜溫硫桿菌的吸附卻受嗜鐵鉤端螺旋菌的嚴重影響；嗜鐵鉤端螺旋菌比喜溫硫桿菌對黃鐵礦有更高的電作用力?；谏鲜鼋Y果，我們提出了競爭吸附模型，解釋嗜鐵鉤端螺旋菌與喜溫硫桿菌對黃鐵礦的競爭吸附機制。上述過程中嗜鐵鉤端螺旋菌處于主導地位。 金屬硫蛋白（MTs）是一類金屬結合蛋白。為了吸附重金屬，本文構建了表達人金屬硫蛋白（hMT-A）基因的大腸桿菌。為了增加蛋白質的穩(wěn)定性，谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）基因與hMT-A基因融合表達。為了增加金屬硫蛋白表達效率和金屬結合容量，分別將兩個、三個和四個金屬硫蛋白基因串聯連接，并在大腸桿菌中表達。表達GST融合三個串聯hMT-A基因的重組大腸桿菌表現了最大的鎘（Cd(II)）和砷（As(III)）生物吸附活性，分別達到 6.36 mg Cd/g dry cell和7.59 mg As/g dry cell。
獲獎情況
- 1. Ma Y, Lin J, Zhang C, Ren Y, Lin J,Cd(II) and As(III) bioaccumulation by recombinant Escherichia coli expressing oligomeric human metallothioneins, journal of hazardous materials 185 (2011) 1605-1608 (SCI影響因子 4.144) 2. Song J, Lin J, Ren Y, and Lin J, Competitive adsorption of binary mixture of Leptospirillum ferriphilum and Acidithiobacillus caldus onto pyrite, Biotechnology and Bioprocess Engineering 15：923-930 (2010) (SCI影響因子 1.412) 3. Gao L, Ren Y, Lin J, Lin J, 2011, Modeling and simulation of production of metallothionein and red fluorescent fusion protein by recombinant E. coli using graphical programming, in: Labview - Modelling, Programming and Simulations. Intech Press.
鑒定結果
- 混合浸礦微生物競爭吸附模型，可用于指導生物冶金工藝優(yōu)化、工藝設計；構建了高效串聯表達金屬硫蛋白基因的質粒載體，并轉入大腸桿菌構建了重金屬高親和力生物吸附劑，可以高效率地去除水中低濃度的重金屬。
參考文獻
- [1] 楊顯萬，沈慶峰，郭玉霞, (2003). 難處理金礦的細菌氧化預處理. 微生物濕法冶金. pp165-167. [2] 楊洪英，楊立.（2000）.細菌氧化難浸金礦石的礦物學研究探討. 有色金屬. 52（1）：86-89.
同類課題研究水平概述
- 極端嗜酸性自養(yǎng)微生物轉基因技術是本研究團隊利用結合轉移技術在國際上率先取得突破的。之后，國際上又有兩個研究團隊用同樣方法成功進行了同類菌的轉基因工作，其中之一是本研究室人員出國去歐洲做的工作，另一個是該領域國際知名專家D.E. Rawlings研究室的工作。2010年，我們用比結合轉移技術效率更高的電轉化技術實現了生物冶金微生物喜溫硫桿菌（Acidithiobacillus caldus）的基因轉移[1]，繼續(xù)保持了極端嗜酸性自養(yǎng)微生物基因轉移技術的國際領先地位。在本研究中，我們利用上述技術對喜溫硫桿菌進行了遺傳改造，促進了該菌的生長代謝。國內除我們團隊外，在極端嗜酸性自養(yǎng)微生物轉基因技術方面沒有其它報道。 混合浸礦菌對礦石的吸附是礦物直接生物氧化機理的前提。但多數研究只研究了混合菌總數變化規(guī)律，沒有區(qū)分混合菌內發(fā)揮不同作用的各菌的比例。本研究利用分子生物學方法定量研究了混合吸附各菌的數量，建立了新的吸附模型。 在串聯表達金屬硫蛋白基因，構建高效、高親和力重金屬生物吸附劑方面，也具有很高的創(chuàng)新性，在環(huán)境科學頂級雜志發(fā)表并獲得了審稿人的好評。 1. Chen L， Lin J，Li B，Lin J，Liu X，2010，Method development for electrotransformation of Acidithiobacillus caldus，J. Microbiol. Biotechnol. 20(1), 39–44.
