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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- KA1表達(dá)再分布對(duì)神經(jīng)元興奮毒性的影響
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 神經(jīng)元興奮性中毒死亡是癲癇發(fā)病的重要機(jī)制，我們運(yùn)用海馬內(nèi)立體定位注射KA誘導(dǎo)的小鼠癲癇模型，觀察Bederson體征評(píng)分變化，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)比觀察。我們的研究提示了海馬內(nèi)KA1表達(dá)的變化在神經(jīng)元興奮性中毒死亡過(guò)程中的重要作用，其可能作為第二信使誘導(dǎo)遲發(fā)性神經(jīng)元興奮性中毒死亡，為研究以KA1為作用靶點(diǎn)的有效藥物提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 神經(jīng)元興奮性中毒死亡是癲癇發(fā)病的重要機(jī)制，而興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和受體在神經(jīng)元死亡過(guò)程中的作用以及特異性的藥物作用分子靶點(diǎn)研究是一個(gè)重要方向，其中NMDA受體和AMPA受體的研究取得了較大進(jìn)展, 但關(guān)于KA受體的功能和詳細(xì)的分子機(jī)制仍不清楚。我們運(yùn)用海馬內(nèi)立體定位注射KA誘導(dǎo)的小鼠癲癇模型，觀察Bederson體征評(píng)分變化，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)比觀察全腦切片中KA受體亞型KA1的表達(dá)、表達(dá)再分布的變化情況、體視細(xì)胞剖面計(jì)數(shù)法計(jì)算死亡神經(jīng)元數(shù)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，海馬內(nèi)KA注射2小時(shí)后，KA1受體在CA1區(qū)的表達(dá)明顯上調(diào), 4小時(shí)后CA1區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)元死亡，6小時(shí)可見(jiàn)大量神經(jīng)元死亡，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著意義。我們的研究提示了海馬內(nèi)KA1表達(dá)的變化在神經(jīng)元興奮性中毒死亡過(guò)程中的重要作用，其可能作為第二信使誘導(dǎo)遲發(fā)性神經(jīng)元興奮性中毒死亡，為研究以KA1為作用靶點(diǎn)的有效藥物提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
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作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 目的：揭示KA1在腦缺血、癲癇等所致神經(jīng)細(xì)胞死亡中的作用及機(jī)理；逐步建立相關(guān)原創(chuàng)性理論體系?；舅悸罚横槍?duì)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和受體在神經(jīng)元死亡過(guò)程中所起作用的研究現(xiàn)狀，提出KA受體亞型KA1在腦缺血、癲癇等所致神經(jīng)元死亡的過(guò)程中起著一個(gè)重要作用的假說(shuō)，通過(guò)運(yùn)用小鼠模型，結(jié)合神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化觀察進(jìn)行研究，探索KA1亞受體在神經(jīng)元興奮性中毒死亡過(guò)程中的作用及可能的臨床應(yīng)用。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 攝取了目前國(guó)際上對(duì)興奮性神經(jīng)細(xì)胞死亡分子機(jī)理研究的新進(jìn)展，而目前世界上還沒(méi)有關(guān)于KA受體亞單位KA1表達(dá)的再分布與神經(jīng)細(xì)胞興奮性死亡中的關(guān)系研究先例，這正是我們這項(xiàng)研究的創(chuàng)新之處，相信我們這項(xiàng)研究將為有效治療腦缺血、癲癇等,以及藥物選擇、藥品開(kāi)發(fā)、臨床應(yīng)用等方面提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本項(xiàng)研究說(shuō)明KA的注射導(dǎo)致了海馬神經(jīng)元興奮性毒性，能填補(bǔ)谷氨酸受體對(duì)許多神經(jīng)退行性疾病變化這一區(qū)域的空白，為后續(xù)的研究提供參考。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：探究小鼠顱內(nèi)注射KA之后小鼠海馬不同區(qū)域KA1再分布狀況對(duì)中樞神經(jīng)元興奮性中毒的影響。方法：成年雄性小鼠海馬內(nèi)注射KA與PBS，2小時(shí)后進(jìn)行Bederson體征評(píng)分和腦切片免疫組化檢測(cè)。結(jié)果：Bederson評(píng)分的結(jié)果證明KA海馬內(nèi)注射后中樞神經(jīng)元功能的損傷嚴(yán)重；注射KA后，KA1表達(dá)的上調(diào)主要出現(xiàn)在海馬CA1區(qū)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞大量死亡。結(jié)論：KA促使KA1在海馬神經(jīng)元CA區(qū)重新分布，并誘導(dǎo)明顯的興奮毒性,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，中樞神經(jīng)功能缺失。
獲獎(jiǎng)情況
- 文章已投遞到生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展期刊
鑒定結(jié)果
- 屬實(shí)
參考文獻(xiàn)
- 1.動(dòng)物模型制作：海馬內(nèi)注射和切片制作 將小鼠進(jìn)行麻醉后固定在腦立體定位儀上，使用微量注射器注射藥物。麻醉清醒并于注射藥物兩小時(shí)后，對(duì)小鼠進(jìn)行Bederson體征評(píng)分，隨后灌流，取全腦,后固定，并切片。 2.免疫組織化學(xué)方法[1] 將切片置于5%血清和0.3% Triton -100的PBS溶液中反應(yīng)。將切片置于4℃含一抗的5%血清和0.3% Triton -100的PBS溶液中反應(yīng)過(guò)夜，次日經(jīng)PBS浸洗后，切片在相應(yīng)的熒光二抗里孵育2小時(shí),然后檢測(cè)。 3. FJB染色[2-3] 將固定的腦切片移至載玻片，55℃干燥2小時(shí)，使用0.0004% FJB染色20分鐘。通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。死亡細(xì)胞定量計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用剖面計(jì)數(shù)法，在油鏡下對(duì)FJB染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過(guò)Student t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 4.圖像分析 獲得的所有圖片，均利用BX51/BX52系統(tǒng)，在熒光顯微鏡下觀察、Photoshop (Adobe)處理所得。 文獻(xiàn)：1. Chen, Z.-L., J.A. Indyk, T.H. Bugge, K.W. Kombrinck, J.L. Degen, and S. Strickland. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J. Neurosci. ,1999,19:9813–9820. 2.Schmued, L.C., and K.J. Hopkins. Fluoro-Jade B: a high affinity fluorescent marker for the localization of neuronal degeneration. Brain Res,2000,874:123-130 3.Chen, Z.L., J.A. Indyk, and S. Strickland. The hippocampal laminin matrix is dynamic and critical for neuronal survival. Mol. Biol. Cell,2003,14:2665–2676.
同類課題研究水平概述
- 興奮性氨基酸是廣泛存在于哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸興奮傳遞，學(xué)習(xí)記憶形成以及與多種神經(jīng)變性疾病有關(guān)，例如，中風(fēng)、缺氧、癲癇等，在這些病理情況下，細(xì)胞外谷氨酸濃度的異常增高，過(guò)度刺激其受體，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的毒性作用。而興奮性中毒是導(dǎo)致這些神經(jīng)變性疾病中神經(jīng)元死亡的主要潛在機(jī)制。根據(jù)谷氨酸配體的特異性可分為三種亞型：NMDA受體、AMPA受體和KA受體。其中NMDA受體和AMPA受體在腦中風(fēng)所致神經(jīng)細(xì)胞死亡中的作用受到了廣泛密切的關(guān)注,并就其在腦內(nèi)分布特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)、電生理、作用離子通道等諸多方面展開(kāi)了深入的研究。AMPA受體廣泛分布于大腦皮質(zhì)、邊緣系統(tǒng)、丘腦，是一種跨膜受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要介導(dǎo)大多數(shù)突觸的快速興奮性突觸傳遞。有研究顯示，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭凶钄郚MDA受體能明顯減少腦中風(fēng)所致神經(jīng)細(xì)胞死亡，但在臨床應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)中其效果并不明顯，其原因是NMDA受體在正常腦功能中起著非常重要的作用，抑制或阻斷其功能可使病人意識(shí)喪失乃至昏迷，并導(dǎo)致其它非常嚴(yán)重的毒副作用，因此臨床應(yīng)用受到極大的限制。較NMDA受體而言，KA受體有5種亞型分別是KA1，KA2（高親和力結(jié)合位點(diǎn)），GluR5，GluR6，GluR7（低親和力KA結(jié)合位點(diǎn)）。其在正常生理狀況下并不像NMDA和AMPA受體分布那樣廣泛，主要集中分布在以下幾個(gè)部位：海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)、小腦、杏仁核和脊髓，放射配體結(jié)合試驗(yàn)表明，在這些表達(dá)KA 受體的部位，海馬CA3區(qū)的含量特別高，并且在不同區(qū)域的亞基組成具有較大的差異，KA受體在諸如腦卒中、癲癇發(fā)作等病理狀況下其表達(dá)增加，并可能加重病理變化。正是這些KA 受體亞基在不同區(qū)域組成成分的不同，才賦予了不同區(qū)域的KA受體獨(dú)特的性質(zhì)和特定的功能。海馬CA1區(qū)較CA3區(qū)對(duì)缺血損傷敏感是由于其興奮性氨基酸受體的類型不同，CA1區(qū)以NMDA受體為主，CA3區(qū)以KA受體為主，而KA受體對(duì)缺血敏感性較差，可能是造成遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(DND)發(fā)生的重要原因。這是目前有關(guān)腦中風(fēng)致神經(jīng)細(xì)胞興奮性中毒死亡機(jī)理研究的一個(gè)重要方向。
