基本信息
- 項目名稱：
- 草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因克隆、表達與酶學性質(zhì)研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本實驗克隆到一個全新的草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（GAT）基因，能使除草劑草甘膦N乙?；?，使其失去對植物的毒害作用。通過蛋白質(zhì)工程方法有望大幅度提高該酶活性，使其最終可以應用于轉(zhuǎn)基因作物。
- 詳細介紹：
- 草甘膦是世界上應用最廣、產(chǎn)量最大的除草劑，是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導型優(yōu)秀除草劑，廣泛用于果園、膠園、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后處理，以及出苗后定向處理?？寺『脱芯靠共莞熟⒒?，并將其應用于作物中，能使目標作物不受草甘膦毒害，從而達到除草的目的。 本實驗從深海微生物中克隆到一種草甘膦耐受基因，草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（GAT）基因，能夠催化一個轉(zhuǎn)乙?；姆磻?，將乙酰輔酶A（AcCoA）上的乙?；D(zhuǎn)移至草甘膦的亞氨基上，生成無毒的N乙酰草甘膦，從而解除其毒性。 原始GAT活性較低，結合蛋白質(zhì)工程手段，對GAT基因進行定向進化，篩選得到高活性的基因?qū)⒂型蛊鋺糜谵D(zhuǎn)基因作物中。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：從深海微生物中分離克隆抗除草劑草甘膦基因，并分析其蛋白質(zhì)酶學性質(zhì)，結合計算機輔助設計預測其三維結構，進行定點突變研究其分子機理，為進一步應用于抗草甘膦作物提供理論基礎。 基本思路：從深海中篩選抗草甘膦菌株→構建基因組文庫→篩選分離抗草甘膦基因→表達純化蛋白酶→酶學性質(zhì)分析→計算機輔助設計預測三維結構→定點突變→突變效果分析→分析分子機理
科學性、先進性及獨特之處
- 本研究材料來自深海微生物，通過常規(guī)的分子克隆技術成功克隆到一個新型的抗除草劑草甘膦基因，利用計算機輔助設計從蛋白質(zhì)工程水平揭示其分子機理，為其應用轉(zhuǎn)基因作物提供了一定的理論基礎。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 實際應用中的絕大數(shù)農(nóng)藥的主要成分為草甘膦及其衍生物，而且市場上的抗草甘膦作物均為孟山都等國外大型生物公司的產(chǎn)品。該研究旨在得到具有自主知識產(chǎn)權的抗草甘膦基因，并將其應用于水稻、棉花等農(nóng)作物中。該研究不僅具有巨大的市場價值，而且有望培育出具有自主知識產(chǎn)權的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物。
學術論文摘要
- 草甘麟是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導型的除草劑，對人畜低毒，低殘留，有很高的商業(yè)價值，在全世界范圍內(nèi)得到了廣泛使用。草甘磷N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)是一種能夠通過轉(zhuǎn)乙酰基的反應將草甘膦代謝為低毒物質(zhì)-乙酰草甘膦的酶。草甘膦N-乙?；癁樽魑锟共莞熟⑻峁┝瞬煌贓PSPS途徑的全新作用機制，它在抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物中具有潛在的應用價值。本研究從深海微生物中篩選獲得一株產(chǎn)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的細菌Pseudomonas balearica SP1402。通過構建基因組文庫，克隆了該新的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，并將其克隆在表達載體pGEX -6p-1上組成重組質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達、純化，進行酶學性質(zhì)研究，并結合計算機輔助設計和蛋白質(zhì)工程的方法研究其分子機理。 本研究中的GAT是從含10 mmol/L草甘膦的M9基礎培養(yǎng)基上篩得，全長1218bp，編碼205個氨基酸，在氨基酸水平上，與Pseudomonas stutzeriA1501同源性最高（92%），與已知可GAT同源性只有4.94%。
獲獎情況
- 無
鑒定結果
- 無
參考文獻
- 本研究主要涉及常規(guī)的分子克隆技術（包括DNA抽提與酶切、載體制備、酶連、轉(zhuǎn)化）、生物信息學方法（基因預測、Blast比對）、酶學性質(zhì)分析（蛋白質(zhì)純化、酶活測定）、蛋白質(zhì)工程技術（同源建模、定點突變）等技術。主要參考技術文獻： 1.J．薩姆布魯克,D.W.拉塞爾.分子克隆實驗指南（2002年第8版） 2. Daniel L. Siehl.et al. The Molecular Basis of Glyphosate Resistance by an Optimized Microbial Acetyltransferase. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.282,NO.15,pp.11446–11455, April 13, 2007 3. Linda A. Castle.et al. Discovery and Directed Evolution of a Glyphosate Tolerance Gene. Science 304, 1151 (2004)
同類課題研究水平概述
- 目前已發(fā)現(xiàn)的抗草甘膦的途徑有三種： 一、提高EPSP合成酶的表達量降低草甘膦的抑制作用或克隆對草甘膦不敏感的EPSP合成酶基因。 二、草甘膦降解途徑。研究發(fā)現(xiàn)，C-N鍵斷裂生成氨甲基磷酸 (AMPA)和C-P鍵斷裂生成肌氨酸是草甘膦降解主要途徑。這兩種中間代謝物進一步代謝為磷酸、甘氨酸和二氧化碳等，為細菌提供磷源、碳源或氮源。大部分微生物降解中間產(chǎn)物為AMPA，并以共代謝的形式進行，即部分細菌將草甘膦降解為AMPA而另一些則將AMPA徹底降解。 三、草甘膦生物轉(zhuǎn)化途徑。2004年Linda A. Castle等人發(fā)現(xiàn)一種全新的抗草甘膦基因草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶gat基因，能夠催化一個轉(zhuǎn)乙?；姆磻?，將草甘膦代謝成低毒物質(zhì)的乙酰草甘膦，減少除草劑對植物的影響。 目前有關gat基因抗草甘膦的分子機理的報道只有一篇（Daniel L. Siehl等人，2004年），且該gat基因的活性位點已被專利保護。本實驗室發(fā)現(xiàn)的gat基因與Linda A. Castle發(fā)現(xiàn)的gat基因同源性極低，是一個嶄新的gat基因，其作用機理、活性位點都有待進一步研究，通過計算機輔助設計和蛋白質(zhì)工程手段將進一步提高該基因的抗草甘膦活性，有望將其應用于轉(zhuǎn)基因作物中，獲得具有自主知識產(chǎn)權的抗草甘膦作物。
