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基本信息
- 項目名稱：
- 豬pGH基因真核表達載體的構(gòu)建及其表達
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 豬生長激素生物學(xué)效應(yīng)表現(xiàn)為可促進蛋白質(zhì)合成和脂肪動用，顯著提高豬的生長速度、飼料報酬和降低動物體脂肪含量，因此構(gòu)建高效表達pGH基因的載體，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物可以提高豬的生長速度，降低飼養(yǎng)成本。本試驗采用采用的pEGFP-N1載體含有高效的功能強大的啟動子SV40 和PCMV，可以使目的基因在增殖的細胞中穩(wěn)定表達。
- 詳細介紹：
- 本研究采取RT-PCR法，得到pGH基因的cDNA序列，然后通過設(shè)計引物得到cDS序列，然后運用DNA重組技術(shù)將其連接到T載體上，測序完成后酶切，連接到表達載體pEGFP-N1上，得到了可以高效表達pGH基因的載體，并在PK15細胞中表達，本研究在設(shè)計引物時，去掉了pGH基因的終止密碼子，使得標(biāo)記基因-熒光蛋白基因和目的基因-pGH基因融合表達，證明了該載體真核表達的可實現(xiàn)性，同時也快捷的驗證了pGH基因在細胞內(nèi)的表達，為下一步的轉(zhuǎn)基因動物的研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- pGH基因可以顯著提高豬的生長速度、飼料報酬和瘦肉率具有明顯的經(jīng)濟效益和社會效益。 本實驗選擇長白豬的pGH基因，并對其進行克隆、測序、連接，得到真核表達載體，并將其轉(zhuǎn)染PK15細胞，得到表達熒光的細胞圖片，證明了該真核表達載體的可應(yīng)用性，旨在為進一步研究節(jié)糧型高瘦肉率轉(zhuǎn)基因豬，及其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 隨著對基因表達調(diào)控、蛋白在活細胞中自然狀態(tài)下變化的深入研究，人們對報告基因或標(biāo)記基因的要求越來越高。本試驗采用采用的pEGFP-N1載體含有高效的功能強大的啟動子SV40 和PCMV，可以使目的基因在增殖的細胞中穩(wěn)定表達。該載體具有易轉(zhuǎn)染真核細胞的特點，且EGFP是一種突變體，能在異源組織中表達并產(chǎn)生熒光，僅需要一定波長的光激發(fā)，而且不影響靶蛋白的功能和宿主細胞。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 生長激素在動物的生長發(fā)育過程中有著重要的生理功能。豬生長激素是單一肽鏈蛋白質(zhì)類激素，屬于內(nèi)源激素，但外源GH能顯著改善豬生長速度、胴體品質(zhì)和生長效率，同時減少飼料消耗和豬脂肪沉積。pGH基因可以顯著提高豬的生長速度、飼料報酬和瘦肉率具有明顯的經(jīng)濟效益和社會效益。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 從120日齡的長白豬腦垂體組織中擴增出pGH基因的cDNA， 采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 技術(shù)，通過DNA重組技術(shù)將該基因片段重組于pEGFP-N1真核表達載體上，構(gòu)建pEGFP-N1-pGH重組質(zhì)粒。通過PCR擴增、酶切電泳分析和測序的方法對重組DNA進行鑒定，并將其轉(zhuǎn)染PK15細胞，通過熒光素酶活性檢測特異性表達強度。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pEGFP-N1-pGH真核表達載體，為轉(zhuǎn)基因豬的研究奠定了基礎(chǔ)。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- [1] Lebail P Y, Sire M F ,Vemier J M. 1989.Intestinal transfer for growth hormone into the circulatory system of the rainbow trout salmo gaindneri : interference by granule cell [J] . Exp Z ool , 251 (1) :101. [2] Georgopoulou C ,Sire M F ,Vernier J M.1986. Immunological demonstration of intestinal absorption and digestion of protein macromolecules in the trout ( Salno fai- rdneri) [J] . Cell Tissue Rcs ,245 (2) :387. [3] Mclean E ,Donaldson E M ,Dye H M ,et al.1990.Growth acceleration of coho salmon (Onconhynchus hisutch) following oral administration of recombinant bovine sornstotropin [J] . Aquaculture, 91 :197. [4] Franchimont P,Burger H. 1975.Human Growth Hormone and Gonadotripins in Health and Disease. Amsterdam, Elsevier. [5].Alvarez-Dolado,M.,Pardal,R.,Garcia-Verdugo,J.M.,et al.2003.Fusion of bone marrow-derived cells with Purkinje neurons,cardiomyocytes and hepatocytes.Nature 425,968–973.
同類課題研究水平概述
- 豬生長激素基因pGH cDNA ORF編碼216個氨基酸殘基。豬生長激素基因的原核表達及其抗體制備：將pGH基因亞克隆到原核表達載體pGEX4T-1中，構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pGEX4T-1／pGH。誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果表明出現(xiàn)與預(yù)期一致的1條50.4KDa的特異蛋白新帶，重組pGH得到了正確表達。分離包涵體形式表達的融合蛋白GST-pGH，透析得到的重組融合蛋白進行家兔免疫，制備并純化抗pGH的多克隆抗體；經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測定、蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)方法檢測，結(jié)果證實制備的抗血清對豬生長激素具免疫特異性。Western Blotting檢測結(jié)果表明：豬天然pGH蛋白和融合表達蛋白GST-pGH能特異性結(jié)合該pGH多抗，豬腦垂體組織的免疫組化分析結(jié)果也證實了pGH多克隆抗體的特異性。 通過構(gòu)建表達質(zhì)粒pPIC-3.5K／pGH，我們研究了豬生長激素基因在酵母細胞中的表達。將豬生長激素(pGH)基因cDNA編碼區(qū)片斷定向插入pMD18-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用菌落PCR和質(zhì)粒PCR方法篩選陽性克??；以BamH I和EcoRI酶切鑒定重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用BamH I和EcoR I酶切，膠回收目的酶切片斷并定向插入pPIC-3.5K質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為PPIC-3.5K／pGH。該重組質(zhì)粒經(jīng)SalI酶切線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化GS115酵母，采用MD和MM培養(yǎng)基篩選重組子，提取初篩重組子的基因組DNA。PCR方法進一步鑒定，獲得的重組酵母菌以甲醇誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，復(fù)篩得到高效表達pGH的重組酵母，命名為pPIC-3.5K／pGH／GS115。豬生長激素基因在哺乳動物細胞中的表達：將pGH cDNA亞克隆到真核表達載體VR1020上，構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒VpGH；利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞株COS_7，分別于24h、48h、72h提取轉(zhuǎn)染細胞總RNA，對轉(zhuǎn)染后的COS_7細胞進RT-PCR、ELISA和免疫熒光分析。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細胞24小時總RNA中已含有目的cDNA片段轉(zhuǎn)錄的對應(yīng)mRNA；ELISA和免疫熒光分析結(jié)果表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的COS_7細胞中表達了pGH基因的蛋白產(chǎn)物。
