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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 小鼠ISG15基因5′調(diào)控區(qū)序列的克隆及序列分析
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本文采用LA-PCR 技術(shù)擴(kuò)增小鼠ISG15基因1194bp的5′調(diào)控區(qū)序列，構(gòu)建了重組克隆載體pEGFP-N1-ISG15，對陽性克隆進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、限制性酶切鑒定、DNA測序及生物信息學(xué)分析。為進(jìn)一步確定小鼠ISG15基因核心啟動子區(qū)域及該基因的表達(dá)調(diào)控奠定了理論基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- ISG15基因作為一種細(xì)胞因子，能夠激活CD56+自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK）的增殖，對小鼠ISG15基因表達(dá)調(diào)控的研究有利于闡明小鼠的固有免疫及對辛德比斯病毒、流感病毒及人合胞體病毒等疾病的抗性機(jī)制，為動物的分子育種及抗病育種工作提供理論依據(jù)。本文分別提取3種組織樣的DNA并進(jìn)行擴(kuò)增，在小鼠脾、肝臟中均擴(kuò)增出ISG15基因啟動子區(qū)，而在克隆中發(fā)現(xiàn)肌肉組織樣中沒有擴(kuò)增出ISG15基因啟動子區(qū)，其原因可能在于肌肉組織中不含有ISG15基因或含量很少，以至于無法通過PCR克隆。本文成功克隆了長為1194bp的5′調(diào)控區(qū)，它與GenBank上公布的序列相似性為99.92%。Kerr I M 等通過功能檢測方法從干擾素家族的調(diào)控序列中找到對ISGs表達(dá)具特異增強(qiáng)作用的寡核苷酸片段，得出干擾素家族具有兩個(gè)必需的小片段：一是GGAAA，存在于SV40增強(qiáng)子核心區(qū)；另一是TGAAACT，位于第一小段下游，但I(xiàn)SG15基因不具有該小段。本實(shí)驗(yàn)用生物學(xué)軟件對獲得的5′調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行了相應(yīng)的生物信息學(xué)的分析，證實(shí)了這一結(jié)論。ISG15基因啟動子區(qū)ISRE元件中存在必需小片段GGAAA,沒有發(fā)現(xiàn)小片段TGAAACT，另外啟動區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)完全一致的NF-kB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)類似結(jié)合位點(diǎn)位于-469至-477。此外，我們發(fā)現(xiàn)小鼠的ISG15基因5′端非編碼區(qū)有五處enhancer區(qū)和一處ISRE元件，這些區(qū)域的小片段可能是ISG15基因啟動區(qū)域的核心增強(qiáng)子片段，另外該區(qū)域也存在著潛在的SP1、H4TF-2、GAS等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。該區(qū)域還發(fā)現(xiàn)3處重復(fù)元件，這些重復(fù)元件可能與保護(hù)基因啟動子及其它調(diào)控元件等“脆弱”部位免受因突變而引起的功能喪失有關(guān)，但這些重復(fù)元件的具體作用目前還不清楚。本試驗(yàn)成功克隆出長1194bp的ISG15基因 5′調(diào)控區(qū)片段并對該啟動子區(qū)運(yùn)用生物學(xué)軟件進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析，從而對ISG15基因5′調(diào)控區(qū)獲得了更深入的認(rèn)識。然而，要更深一步研究ISG15基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，需要利用克隆獲得的5′調(diào)控區(qū)序列構(gòu)建相關(guān)的報(bào)告基因載體，然后轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞系，分段對啟動子區(qū)活性進(jìn)行表達(dá)分析，來確定該基因的核心增強(qiáng)子區(qū)及重要的調(diào)控元件。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 為進(jìn)行ISG15基因5′調(diào)控區(qū)序列的克隆及序列分析,采用LA-PCR 技術(shù)擴(kuò)增小鼠ISG15基因1194bp的5′調(diào)控區(qū)序列，構(gòu)建了重組克隆載體pEGFP-N1-ISG15，對陽性克隆進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、限制性酶切鑒定、DNA測序及生物信息學(xué)分析
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 試驗(yàn)成功構(gòu)建了包含小鼠ISG15基因5′調(diào)控區(qū)的重組質(zhì)粒；經(jīng)同源性比對發(fā)現(xiàn)ISG15基因5′調(diào)控區(qū)在不同物種中同源性不高；經(jīng)過預(yù)測該調(diào)控區(qū)富含GAS、GR、SP1、 NF-1、CBF-B 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，有五處Enhancer區(qū)、一處ISRE元件以及一處保守的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。本研究為進(jìn)一步確定小鼠ISG15基因核心啟動子區(qū)域及該基因的表達(dá)調(diào)控奠定了理論基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 小鼠ISG15基因的5′調(diào)控區(qū)的克隆及對其生物信息學(xué)的分析，為小鼠ISG15基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控及其與動物先天性抗病毒、炎癥等性狀相關(guān)性方面的研究提供科學(xué)理論依據(jù)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本文采用LA-PCR 技術(shù)擴(kuò)增小鼠ISG15基因1194bp的5′調(diào)控區(qū)序列，構(gòu)建了重組克隆載體pEGFP-N1-ISG15，對陽性克隆進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、限制性酶切鑒定、DNA測序及生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：試驗(yàn)成功構(gòu)建了包含小鼠ISG15基因5′調(diào)控區(qū)的重組質(zhì)粒；經(jīng)同源性比對發(fā)現(xiàn)ISG15基因5′調(diào)控區(qū)在不同物種中同源性不高，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)近端的啟動子區(qū)域中小鼠與人、牛、烏鱧的同源性分別為41.36%，37.89%，38.71%；經(jīng)過預(yù)測該調(diào)控區(qū)富含GAS、GR、SP1、 NF-1、CBF-B 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，有五處Enhancer區(qū)、一處ISRE元件以及一處保守的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。本研究為進(jìn)一步確定小鼠ISG15基因核心啟動子區(qū)域及該基因的表達(dá)調(diào)控奠定了理論基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- [1] Pitha-Rowe I F, Pitha P M. 2007,Viral defense, carcinogenesis and ISG15:novel roles for an old ISG[J].Cytokine Growth Factor Rev,18(5-6):409-417. [2] Whitmarsh A J.Filamin B,2009,: a scaffold for interferon signalling[J].EMB0 Rep,10(4):349-351. [3] Der SD et al.1998,Identification of genes differentially regulated by interferon alpha, beta, or gamma using oligonucleotide arrays.Proc Natl Acad Sci USA,95:15623-15628. [4] D’Cunha J et al.1996, Immunoregulatory properties of ISG15, an interferon induced cytokine. Proc Natl Acad Sci USA,93:211-215. [5] Knight E Jr et al.1988, A 15-kDa interferon-induced protein is derived by COOH-terminal processing of a 17-kDa precursor. J Biol Chem,263(10):4520-4522. [6] Yuan W, Krug RM.2001,Influenza B virus NS1 protein inhibits conjugation of the interferon (IFN)-induced ubiquitin-like ISG15 protein.[J]. Embo J. 20(3): 362-371.
同類課題研究水平概述
- 干擾素刺激基因15（ISG15）編碼的蛋白是抗病毒天然免疫通路中的重要調(diào)節(jié)因子,病毒感染和干擾素刺激均可強(qiáng)烈誘導(dǎo)ISG15的表達(dá)。ISG15是最早發(fā)現(xiàn)的泛素樣蛋白,可對細(xì)胞內(nèi)多種蛋白進(jìn)行修飾并調(diào)節(jié)蛋白功能,但不介導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解,在機(jī)體抗病毒天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,其機(jī)制尚未完全明確。近幾年對ISG15的研究有所突破,發(fā)現(xiàn)了ISG15在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的新功能。 ISG15 cDNA全長758nt，包含468nt的開放閱讀框，編碼155個(gè)氨基酸，含有兩個(gè)泛素樣（UBL）結(jié)構(gòu)域，C末端具有保守的UB偶聯(lián)結(jié)構(gòu)（LRGG）.ISG15啟動子區(qū)存在保守的干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）和γ干擾素激活序列（GAS）. ISRE是干擾素刺激基因啟動子區(qū)的重要特征，并與干擾素調(diào)控因子（IRF）1和IRF2的識別序列（IRFE）部分重復(fù)；GAS參與介導(dǎo) II 型干擾素激活基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄. 此外，ISG15啟動子尚存在TATA，CAAT，Sp1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn). 烏鱧ISG15基因5′非編碼區(qū)含有單一的內(nèi)含子，ISG15 mRNA主要表達(dá)在頭腎、后腎、脾臟和鰓，肝臟中也有少量表達(dá)。體內(nèi)干擾素誘導(dǎo)劑poly I：C刺激后，ISG15基因在肝臟的表達(dá)水平明顯增加.
