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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- C型肉毒梭菌的分離及肉毒毒素的制備、鑒定
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 肉毒梭菌廣泛存在于土壤中，對(duì)動(dòng)物尸體旁土壤采用熱處理方法，找出對(duì)新霉素、卡那霉素、多粘菌素具有抗性的單菌落，染色后鏡檢選出疑似菌，經(jīng)生化鑒定確定為C型肉毒梭菌。提取肉毒素后，用蛋白電泳鑒定C型肉毒毒素的重鏈和輕鏈的大小分別為98.0KDɑ和53KDɑ，與理論分子量相符。將脫毒后的C型肉毒毒素與弗氏佐劑乳化后免疫家兔，并收集家兔血清。用抗毒素進(jìn)行瓊擴(kuò)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)抗體效價(jià)和肉毒素的抗原性。
- 詳細(xì)介紹：
- 我們從塔里木大學(xué)校園內(nèi)動(dòng)物尸體旁20-40cm取土壤樣品，分別采用熱處理、50%酒精處理以及熱處理和50%酒精混合處理三種方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，取200ul的處理樣勻漿置于1%葡萄糖皰肉液體培養(yǎng)基中對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)。取富集液倍比稀釋，涂平板36℃厭氧培養(yǎng)24h，選出單菌落。將單菌落分別依次涂于新霉素、卡那霉素、多粘菌素平板上，找出對(duì)新霉素、卡那霉素、多粘菌素具有抗性的單菌落，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢選出疑似菌，通過(guò)肉毒梭菌對(duì)不同糖醇及明膠和七葉苷的分解代謝進(jìn)行生化鑒定得到C型肉毒梭菌。將鑒定后的C型肉毒梭菌至于pH 7.2-7.4的1%葡萄糖皰肉培養(yǎng)基36℃進(jìn)行厭氧產(chǎn)毒培養(yǎng)3-5天，用飽和硫酸銨分離毒素。將分離的毒素置于透析袋中純化并濃縮肉毒毒素，采用SDS-PAGE電泳鑒定C型肉毒毒素的重鏈和輕鏈的大小分別為為98.0KDɑ和53.2KDɑ，與理論分子量相符。用65℃ 30min將C型肉毒毒素進(jìn)行脫毒處理，將脫毒后的C型肉毒毒素與弗氏佐劑乳化后制成免疫佐劑，對(duì)家兔進(jìn)行免疫，免疫結(jié)束后收集家兔血清。用抗毒素進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和Western blotting實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)抗體效價(jià)和肉毒素的抗原性。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 肉毒毒素是一種強(qiáng)烈的神經(jīng)毒素。根據(jù)抗原性不同，分為A~G型。C型肉毒素是種高分子蛋白質(zhì)毒素，兩個(gè)亞單位由二硫鍵連接成雙鏈分子。為確切了解和評(píng)價(jià)C型肉毒素的特點(diǎn)，我們分離鑒定C型肉毒梭菌和肉毒毒素，為進(jìn)一步的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，也為其他研究者提供理論依據(jù)，有助于深入研究肉毒梭菌及毒素。先分離鑒定C型肉毒梭菌；再提取純化C型肉毒毒素；最后制備C型肉毒毒素的抗毒素。研究C型肉毒素的抗原性，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，立項(xiàng)依據(jù)充分，實(shí)驗(yàn)方法正確，結(jié)論真實(shí)可信，結(jié)果可為研究者提供參考。隨著各型肉毒毒素的生物特性、藥理作用方面研究的不斷深入，肉毒毒素將得到更廣泛的應(yīng)用。通過(guò)對(duì)肉毒素修飾改造，使毒素應(yīng)用范圍更加擴(kuò)大，應(yīng)用研究有良好的前景，相信將來(lái)對(duì)毒素研究與應(yīng)用會(huì)有更大的突破性進(jìn)展。此外，對(duì)于A型肉毒毒素的研究非常透徹，而對(duì)于C型肉毒素研究較少，因而我們開(kāi)展了此項(xiàng)研究，為深入研究C型肉毒素提供理論依據(jù)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 肉毒毒素微量就可致病甚至致死?，F(xiàn)如今人們生活中越來(lái)越多的食用豆制品以及火腿等食物，在包裝、衛(wèi)生等條件不達(dá)標(biāo)的情況下非常容易導(dǎo)致食物中產(chǎn)生肉毒梭菌及肉毒毒素，對(duì)人們的生活有極大的影響。研究C型肉毒梭菌肉毒素，可以用來(lái)制備生物毒素防治蟲(chóng)鼠害，生物抗衰老作用的發(fā)現(xiàn)也成為另一個(gè)重要原因，同時(shí)對(duì)肉毒素及抗毒素的制備，可以緊急治療肉毒中毒，也可用于檢測(cè)食品中的肉毒素，為食品的安全提供一定的保障。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 肉毒梭狀芽孢桿菌廣泛的存在于土壤、發(fā)酵食物、肉類罐頭食品中。采集動(dòng)物尸體旁土壤、水產(chǎn)市場(chǎng)排水道土壤，通過(guò)對(duì)土壤分別采用熱處理、50%酒精處理及熱處理和50%酒精混合處理三種方法進(jìn)行分離肉毒梭菌，最終在動(dòng)物尸體旁土壤中分離到抗逆細(xì)菌。通過(guò)比對(duì)三種處理方法，得出用50%酒精的處理方法的處理效果最好。通過(guò)肉毒梭菌對(duì)新霉素、卡那霉素、多粘菌素具有抗性這一特性對(duì)已分離的細(xì)菌進(jìn)行選擇培養(yǎng)進(jìn)一步分選，找出對(duì)這三種抗生素具有抗性的單菌落。革蘭氏染色鏡檢選出疑似菌，經(jīng)生化鑒定確定為C型肉毒梭菌。肉毒毒素是肉毒梭菌產(chǎn)生的一種神經(jīng)毒素，能夠通過(guò)抑制神經(jīng)肌肉接頭處的乙酰膽堿釋放而引起肌肉麻痹。肉毒毒素在培養(yǎng)液中以復(fù)合物形式存在，其中的毒性組分由3個(gè)非同源性結(jié)構(gòu)域組成，是一種新型的金屬蛋白酶。不同血清型的肉毒毒素能夠特異性地作用于不同底物，這些底物在神經(jīng)細(xì)胞的胞外分泌過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)提取的C型肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒素進(jìn)行滅活處理后通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行濃度測(cè)定，確定濃度后給家兔進(jìn)行免疫，免疫結(jié)束后心臟采血分離血清。用抗毒素進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和Western blotting實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)抗體效價(jià)和肉毒素的抗原性。
獲獎(jiǎng)情況
- 1、獲得“塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院第二屆學(xué)術(shù)交流會(huì)優(yōu)秀論文三等獎(jiǎng)”； 2、在2010年中國(guó)微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)上發(fā)表論文《肉毒梭菌的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用》
鑒定結(jié)果
- 分離出C型肉毒梭菌，掌握C型肉毒梭菌培養(yǎng)條件并提取肉毒素，用蛋白印跡技術(shù)鑒定出肉毒素重、輕鏈大小約為98KDɑ和53KDɑ。用瓊擴(kuò)檢測(cè)抗體效價(jià)為1:8，蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)肉毒素抗原性。
參考文獻(xiàn)
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同類課題研究水平概述
- 肉毒梭菌是一種腐物寄生菌。肉毒梭菌在自然界分布廣泛，土壤中常可檢出，江、河、湖、海沉積物，水果，蔬菜，畜、禽、魚(yú)等制品中亦可發(fā)現(xiàn)， 霉干草和畜禽糞便中均存在。早在18世紀(jì)末以前，在歐洲，尤其是在德國(guó)就已被人們所認(rèn)識(shí)，由于那時(shí)候引起中毒的食品主要是臘腸，所以這種中毒就取自臘腸的拉丁文Botulus，而稱為臘腸中毒。在我國(guó)過(guò)去的一些書(shū)中，把本病譯為臘腸中毒，把肉毒梭菌譯為臘腸(毒)桿菌或臘腸(毒)梭菌。引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品。這些食品是在調(diào)制加工、運(yùn)輸貯存的過(guò)程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在適宜條件下，發(fā)芽、增殖并產(chǎn)生毒素所造成的。在國(guó)外，引起肉毒中毒的食品多為肉類及各種魚(yú)、肉制品、火腿，以及豆類、蔬菜和水果罐頭。中毒食品種類往往與飲食習(xí)慣有關(guān)：歐洲各國(guó)主要的中毒食品為火腿，臘腸和其他肉類等。美國(guó)主要是家庭制的水果罐頭，而火腿、臘腸等加工食品僅占7．7％。蘇聯(lián)和日本魚(yú)制品中毒最多，尤其是日本，幾乎全是魚(yú)制品的E型中毒。我國(guó)也有肉毒中毒的報(bào)導(dǎo)，肉類食品及罐頭食品引起的中毒的較少，據(jù)新疆肉毒科研協(xié)作組的223起肉毒中毒的調(diào)查統(tǒng)計(jì)，臭豆腐、豆鼓、面醬、紅豆腐、爛土豆等植物性食品共204起，占91．48％；其余的19起(占8．52％)是動(dòng)物性食品，包括熟羊肉、羊油、豬油、臭雞蛋、臭魚(yú)、咸魚(yú)，臘肉、干牛肉、馬肉等。目前已知肉毒梭菌有A、B、C、D、E、F、G等7個(gè)菌型。引起人中毒的主要是A、B、E三型，C、D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F(xiàn)型只見(jiàn)報(bào)導(dǎo)發(fā)生在個(gè)別地區(qū)，如丹麥和美國(guó)各一起。1980年從瑞士五名突然死亡病例中發(fā)現(xiàn)G型毒素。肉毒梭菌產(chǎn)生的是一種神經(jīng)毒素，是目前已知的化學(xué)毒物與生物毒素中毒性最強(qiáng)烈的一種，對(duì)人的致死量為9-10mg／Kg，其毒力比氰化鉀還大一萬(wàn)倍。肉毒梭菌在自然界的分布上具有區(qū)域性差異。A、B型的分布最廣，其廣泛分布于自然界，各大洲的許多國(guó)家均有檢出，研究較多；C、D型一般多存在于動(dòng)物的尸體中或腐尸附近的土壤中，研究較少；E型多存在于海洋的沉積物、水產(chǎn)品的腸道內(nèi)；F型適應(yīng)于深水的低溫。越來(lái)越多的調(diào)查結(jié)果表明，除G型菌之外，其它各型菌的分布都是相當(dāng)廣泛的。為了確切了解和評(píng)價(jià)C型肉毒素的特點(diǎn)，研究C型肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒素，可以用來(lái)制備生物毒素防治蟲(chóng)、鼠害，同時(shí)抗毒素的研制，可以緊急治療人類因誤食含有肉毒素的食物而中毒，為食品的安全提供一定的保障。
