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基本信息
- 項目名稱：
- 蛹蟲草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶工藝及纖溶酶分離純化的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本實驗項目以纖溶酶活力為指標(biāo)，通過搖瓶培養(yǎng)方式對蛹蟲草的液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化處理，確定最佳發(fā)酵條件，按擬確定的最佳發(fā)酵條件在發(fā)酵罐中進行比擬放大，利用層析法對蛹蟲草發(fā)酵液進行分離提純，確定最佳分離路線。
- 詳細介紹：
- 對蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生纖溶酶的培養(yǎng)基和發(fā)酵控制參數(shù)進行優(yōu)化，通過分析得到液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的最佳工藝條件為：蔗糖2%、豆餅5%；250mL三角瓶裝液量50mL；發(fā)酵時間為5天；蔗糖/豆餅比為2：5；發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為自然（約6-7之間）；發(fā)酵培養(yǎng)接菌量為直徑為1cm的菌片1片；最適培養(yǎng)溫度為21-25℃。在10L發(fā)酵罐中的放大結(jié)果顯示，在攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量為100r/min，600L/h的條件下纖溶酶的溶圈面積可達214.28mm2，相當(dāng)于尿激酶286.21U/mL，較搖瓶條件下的酶活力提高了3.2倍。蛹蟲草通過深層發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶酶經(jīng)過硫酸銨鹽析、Octyl Sepharose FF疏水作用層析、Superdex 75 凝膠過濾層析進行分離純化。樣品經(jīng)Octyl Sepharose FF疏水作用層分離得到兩個活性組分，本實驗收集活性組分II進一步純化，最終纖溶酶活性組分II達到了電泳純。提純后的蛹蟲草纖溶酶II比活力達到2197.66 U/mg，活力回收率為7.85%，純化了68.82倍。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 心腦血管疾病給國家、社會、家庭帶來嚴(yán)重的精神負擔(dān)和經(jīng)濟負擔(dān)，血栓栓塞癥是其主要一類。所以溶栓劑的研究與開發(fā)具有重要意義。微生物生長迅速，活動周期短，生長條件易控制，研究微生物產(chǎn)溶栓劑具有廣闊的發(fā)展前景。本實驗以纖溶酶活力為指標(biāo)，通過搖瓶培養(yǎng)方式對蛹蟲草的液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化處理，確定最佳發(fā)酵條件，按擬確定的最佳發(fā)酵條件在發(fā)酵罐中進行比擬放大，利用層析法對蛹蟲草發(fā)酵液進行分離提純，確定最佳分離路線。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 本實驗貫穿了從蛹蟲草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的優(yōu)化培養(yǎng)體系到大規(guī)模生產(chǎn)體系到分離純化體系的建立，這一系列體系的建立為蛹蟲草纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外對藥用大型真菌深層培養(yǎng)產(chǎn)生生理活性蛋白方面的研究報道較少，研究工作主要集中在優(yōu)化培養(yǎng)條件使菌絲體收獲量提高和提高代謝產(chǎn)物多糖產(chǎn)量及其生理功能方面。蛹蟲草纖溶酶的開發(fā)利用有望彌補目前臨床使用的溶栓藥物的缺陷。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 作為治療和預(yù)防血栓栓塞性疾病的主要藥物，溶栓劑的研究與開發(fā)具有重大的經(jīng)濟效益和社會效益。第一代和第二代溶栓劑在臨床應(yīng)用方面不能盡如人意，第三代溶栓劑還很少投入臨床使用，且基因藥品投入使用需要經(jīng)過較長的試用期。因此溶栓劑的發(fā)展應(yīng)該是在繼續(xù)第三代溶栓劑開發(fā)的同時，把眼光投向從微生物代謝產(chǎn)物中篩選具有更高溶栓效率、更高溶栓選擇性、更長半衰期、更小副作用的新型溶栓劑。所以，本實驗成果具有廣泛的實用價值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本論文對蛹蟲草產(chǎn)纖溶酶的深層培養(yǎng)工藝條件進行了優(yōu)化，在10L發(fā)酵罐中放大成功，并建立了纖溶酶的分離純化流程。對蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的培養(yǎng)基和發(fā)酵控制參數(shù)進行優(yōu)化，通過分析得到液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的最佳工藝條件為：蔗糖2%、豆餅5%；250mL三角瓶裝液量50mL；發(fā)酵時間為5天；蔗糖/豆餅比為2：5；發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為自然（約6-7之間）；接菌量為直徑為1cm的菌片1片；最適培養(yǎng)溫度為21-25℃。在10L發(fā)酵罐中的放大結(jié)果顯示，在攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量為100r/min，600L/h的條件下纖溶酶的溶圈面積可達214.28mm2，相當(dāng)于尿激酶286.21U/mL，較搖瓶條件下的酶活力提高了3.2倍。蛹蟲草通過深層發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶酶經(jīng)過硫酸銨鹽析、Octyl Sepharose FF疏水作用層析、Superdex 75 凝膠過濾層析進行分離純化。樣品經(jīng)Octyl Sepharose FF疏水作用層分離得到兩個活性組分，本實驗收集活性組分II進一步純化，最終纖溶酶活性組分II達到了電泳純。提純后的蛹蟲草纖溶酶II比活力達到2197.66 U/mg，活力回收率為7.85%，純化了68.82倍。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- [1] Alexopoulos C J,Blackwell M,Mims C W.菌物學(xué)概論（第四版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002 [2] Bok J W,Lermer L,Chilton J.Antitumor sterols from the mycelial of Cordyceps sinensis[J].Phytochemistry,1999,51:891-898. [3] Cunningham KG, Manson W , Spring FS, et al.Cordycepin, a Metalmlic Product Isolated from Cultures of Cordyceps Militaris(Lim?)Link.Nature, 1950, 2: 166(4231): 949 [4] IKUMOTOT，SASAKIS，NAMBAH，et al.physiologically active compounds in the extracts from tochukaso and cultured mycelia of Cordyceps and Isaria[J].Yakygaku Zasshi.1991， 111(9)504-509. [5] 魯艷莉,寧喜斌.血栓形成機理及溶血栓藥物的研究進展.食品研究與開發(fā),2006,27.(1)
同類課題研究水平概述
- 韓國的Wodeuk.Kim等從芽孢桿菌（Bacillus sp.CK-114）的分泌物中分離純化得到了一種分子量為28.2KDa的纖溶酶，命名為枯草激酶（CK）。CK的最適溫度為70℃，具有較好的熱穩(wěn)定性，與同類的枯草桿菌蛋白酶激酶相比具有2003年華東師范大學(xué)徐同課題組將蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵所獲得的蛹蟲草材料（菌絲體）經(jīng)10mmol/L PBS(pH8.04)和石英砂研磨，所得提取液經(jīng)離心(4℃,10000rpm,10min)和70%飽和度(NH4)2SO4沉淀后，即可得到具有纖溶活性的粗酶液，命名為“蛹蟲草纖溶酶”；李翠（2008年）從蛹蟲草深層培養(yǎng)液中分離純化得到纖溶酶并對其部分酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。
