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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 一株虎杖糖苷水解酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其酶學(xué)特性的研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 采用濾紙熒光斑點(diǎn)-薄層層析法同步測(cè)定，從瀏陽(yáng)河附近土壤中分離獲得一株虎杖糖苷水解酶活力高的棘孢曲霉Lysgpj-10。粗酶液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化，該酶為β-葡萄糖苷酶，為單體蛋白，分子量為27.3kDa，等電點(diǎn)為4.65。該酶水解虎杖苷的最適pH為5.0，最適溫度為55℃，在此條件下虎杖糖苷水解酶的米氏常數(shù)Km為5 mg/mL虎杖苷，白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率達(dá)98.5%。
- 詳細(xì)介紹：
- 生物轉(zhuǎn)化與催化是生物技術(shù)革命的第三個(gè)浪潮，目前生物轉(zhuǎn)化法制備白藜蘆醇是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本作品采用濾紙熒光斑點(diǎn)-薄層層析法同步測(cè)定，從瀏陽(yáng)河附近土壤中分離獲得一株虎杖糖苷水解酶活力高的菌株Lysgpj-10。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌為棘孢曲霉（Aspergillus.aculeatus CGMCC No.3876）。粗酶液經(jīng)Amicon XM-50超濾濃縮、聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化，該酶為β-葡萄糖苷酶，為單體蛋白，分子量為27.3kDa，等電點(diǎn)為4.65。酶學(xué)特性研究表明，該酶水解虎杖苷的最適pH為5.0，最適溫度為55℃，在此條件下虎杖糖苷水解酶的米氏常數(shù)Km為5 mg/mL虎杖苷，白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率達(dá)98.5%。制備虎杖糖苷水解酶及其復(fù)合酶制劑，開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的制備高純度白藜蘆醇的工藝路線，并用于指導(dǎo)類似天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)，將促進(jìn)我國(guó)生物轉(zhuǎn)化與催化領(lǐng)域的發(fā)展。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 目的：提供一項(xiàng)虎杖糖苷水解酶產(chǎn)生菌的篩菌方案及該酶的分離純化方案。 基本思路： 1、采用濾紙熒光斑點(diǎn)-薄層層析法相組合的篩菌方案； 2、發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化和菌種鑒定，虎杖糖苷水解酶轉(zhuǎn)化PD生成產(chǎn)物的HPLC鑒定； 3、虎杖糖苷水解酶的分離純化及其酶學(xué)特性研究，SDS-PAGE和IEF測(cè)定虎杖糖苷水解酶的分子量和等電點(diǎn)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1、PD的糖苷鍵是β-構(gòu)型，β-葡萄糖苷酶能切斷其糖苷鍵生成Res，因此可通過(guò)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物轉(zhuǎn)化PD生成Res。 2、采用應(yīng)用較為廣泛的虎杖微生物發(fā)酵法。 3、①采用濾紙熒光斑點(diǎn)-薄層層析同步測(cè)定的方法篩選高效菌株；②采用Amicon XM-50、聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化虎杖糖苷水解酶；③虎杖糖苷水解酶酶活力高。米氏常數(shù)Km為5 mg/mL虎杖苷。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 菌株Lysgpj-10發(fā)酵制備的復(fù)合酶能從虎杖材料中高效提取PD及其類似物，提取率為2.3%，未加所述復(fù)合酶（對(duì)照）同等條件下的提取率僅為1.2%，處理提高了91.7%。用所述復(fù)合酶將PD轉(zhuǎn)化為Res，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.5%以上。用分離純化得到的虎杖糖苷水解酶將PD（濃度1.5%）轉(zhuǎn)化為Res，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.7%，提取的Res純度達(dá)98.5%。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 采用濾紙熒光斑點(diǎn)-薄層層析法同步測(cè)定，從瀏陽(yáng)河附近土壤中分離獲得一株虎杖糖苷水解酶活力高的菌株Lysgpj-10。經(jīng)分子生物學(xué)測(cè)定18s rDNA和5.8s rDNA之間ITS保守序列，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)以及形態(tài)學(xué)鑒定，確定該菌為棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus Lysgpj-10 (CGMCC No.3876)）。粗酶液經(jīng)Amicon XM-50超濾濃縮、聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化，該酶為β-葡萄糖苷酶，為單體蛋白，分子量為27.3 kDa，等電點(diǎn)為4.65。酶學(xué)特性研究表明，該酶水解虎杖甙的最適pH為5.0，最適溫度為55℃，在此條件下虎杖糖苷水解酶的米氏常數(shù)Km為5 mg/mL虎杖苷，白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率達(dá)98.5%。
獲獎(jiǎng)情況
- 2011年5月榮獲我校大學(xué)生學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽二等獎(jiǎng)。 2011年5月榮獲我省大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽二等獎(jiǎng)。
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- 1、薄層層析-紫外分光光度法測(cè)定酶解液中Res和PD的含量 [1] 劉新榮, 高麗萍, 夏濤, 鄒偉偉, 陳恩昊. 薄層層析-紫外分光光度法測(cè)定葡萄果皮中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷[J]. 生物學(xué)雜志, 2008, 25（5）. 2、薄層掃描儀測(cè)定薄板上熒光斑點(diǎn)的Res或PD的含量 [1] 舒友琴, 陳敏, 楊喜花, 王巍. 薄層熒光掃描法測(cè)定虎杖中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷[J]. 藥物分析雜志, 2006, 26（9）: 1334-1336. 3、聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化β-葡萄糖苷酶 [1] Yuanshan Lin, Guiguang Chen, Min Ling, Zhiqun Liang. A method of purification，identification and characterization of β-glucosidase from Trichoderma koningii AS3.277[J]. Journal of Microbiological Methods, 2010, 83: 74－81. 4、β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化PD生成產(chǎn)物的HPLC鑒定 [1] 田天麗, 沈競(jìng), 徐萌萌, 王敬, 孫啟玲. 虎杖中虎杖苷的微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 45（2）: 438-440.
同類課題研究水平概述
- 1、袁潤(rùn)蕾的論文（時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008）利用一株根霉菌株T34對(duì)10%虎杖苷粗提物進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，使虎杖苷轉(zhuǎn)化成白藜蘆醇，采用薄層色譜法確定在優(yōu)化發(fā)酵條件下轉(zhuǎn)化時(shí)間為26. 8 h，通過(guò)高效液相色譜法證明虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)95.8%。 2、田天麗的論文（四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2008）從中藥材虎杖中篩選到一株具有轉(zhuǎn)化虎杖苷能力的根霉菌株T234，利用該菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶能將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)98%。
