題-1_100_100.jpg)
基本信息
- 項目名稱：
- 一株虎杖糖苷水解酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其酶學(xué)特性的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 采用濾紙熒光斑點-薄層層析法同步測定，從瀏陽河附近土壤中分離獲得一株虎杖糖苷水解酶活力高的棘孢曲霉Lysgpj-10。粗酶液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化，該酶為β-葡萄糖苷酶，為單體蛋白，分子量為27.3kDa，等電點為4.65。該酶水解虎杖苷的最適pH為5.0，最適溫度為55℃，在此條件下虎杖糖苷水解酶的米氏常數(shù)Km為5 mg/mL虎杖苷，白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率達98.5%。
- 詳細介紹：
- 生物轉(zhuǎn)化與催化是生物技術(shù)革命的第三個浪潮，目前生物轉(zhuǎn)化法制備白藜蘆醇是國內(nèi)外研究的熱點。本作品采用濾紙熒光斑點-薄層層析法同步測定，從瀏陽河附近土壤中分離獲得一株虎杖糖苷水解酶活力高的菌株Lysgpj-10。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌為棘孢曲霉（Aspergillus.aculeatus CGMCC No.3876）。粗酶液經(jīng)Amicon XM-50超濾濃縮、聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化，該酶為β-葡萄糖苷酶，為單體蛋白，分子量為27.3kDa，等電點為4.65。酶學(xué)特性研究表明，該酶水解虎杖苷的最適pH為5.0，最適溫度為55℃，在此條件下虎杖糖苷水解酶的米氏常數(shù)Km為5 mg/mL虎杖苷，白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率達98.5%。制備虎杖糖苷水解酶及其復(fù)合酶制劑，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的制備高純度白藜蘆醇的工藝路線，并用于指導(dǎo)類似天然產(chǎn)物的開發(fā)，將促進我國生物轉(zhuǎn)化與催化領(lǐng)域的發(fā)展。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：提供一項虎杖糖苷水解酶產(chǎn)生菌的篩菌方案及該酶的分離純化方案。 基本思路： 1、采用濾紙熒光斑點-薄層層析法相組合的篩菌方案； 2、發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化和菌種鑒定，虎杖糖苷水解酶轉(zhuǎn)化PD生成產(chǎn)物的HPLC鑒定； 3、虎杖糖苷水解酶的分離純化及其酶學(xué)特性研究，SDS-PAGE和IEF測定虎杖糖苷水解酶的分子量和等電點。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 1、PD的糖苷鍵是β-構(gòu)型，β-葡萄糖苷酶能切斷其糖苷鍵生成Res，因此可通過產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物轉(zhuǎn)化PD生成Res。 2、采用應(yīng)用較為廣泛的虎杖微生物發(fā)酵法。 3、①采用濾紙熒光斑點-薄層層析同步測定的方法篩選高效菌株；②采用Amicon XM-50、聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化虎杖糖苷水解酶；③虎杖糖苷水解酶酶活力高。米氏常數(shù)Km為5 mg/mL虎杖苷。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 菌株Lysgpj-10發(fā)酵制備的復(fù)合酶能從虎杖材料中高效提取PD及其類似物，提取率為2.3%，未加所述復(fù)合酶（對照）同等條件下的提取率僅為1.2%，處理提高了91.7%。用所述復(fù)合酶將PD轉(zhuǎn)化為Res，轉(zhuǎn)化率達99.5%以上。用分離純化得到的虎杖糖苷水解酶將PD（濃度1.5%）轉(zhuǎn)化為Res，轉(zhuǎn)化率達99.7%，提取的Res純度達98.5%。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 采用濾紙熒光斑點-薄層層析法同步測定，從瀏陽河附近土壤中分離獲得一株虎杖糖苷水解酶活力高的菌株Lysgpj-10。經(jīng)分子生物學(xué)測定18s rDNA和5.8s rDNA之間ITS保守序列，構(gòu)建進化樹以及形態(tài)學(xué)鑒定，確定該菌為棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus Lysgpj-10 (CGMCC No.3876)）。粗酶液經(jīng)Amicon XM-50超濾濃縮、聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化，該酶為β-葡萄糖苷酶，為單體蛋白，分子量為27.3 kDa，等電點為4.65。酶學(xué)特性研究表明，該酶水解虎杖甙的最適pH為5.0，最適溫度為55℃，在此條件下虎杖糖苷水解酶的米氏常數(shù)Km為5 mg/mL虎杖苷，白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率達98.5%。
獲獎情況
- 2011年5月榮獲我校大學(xué)生學(xué)術(shù)科技作品競賽二等獎。 2011年5月榮獲我省大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽二等獎。
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- 1、薄層層析-紫外分光光度法測定酶解液中Res和PD的含量 [1] 劉新榮, 高麗萍, 夏濤, 鄒偉偉, 陳恩昊. 薄層層析-紫外分光光度法測定葡萄果皮中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷[J]. 生物學(xué)雜志, 2008, 25（5）. 2、薄層掃描儀測定薄板上熒光斑點的Res或PD的含量 [1] 舒友琴, 陳敏, 楊喜花, 王巍. 薄層熒光掃描法測定虎杖中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷[J]. 藥物分析雜志, 2006, 26（9）: 1334-1336. 3、聚丙烯酰胺凝膠電泳電洗脫二步循環(huán)法分離純化β-葡萄糖苷酶 [1] Yuanshan Lin, Guiguang Chen, Min Ling, Zhiqun Liang. A method of purification，identification and characterization of β-glucosidase from Trichoderma koningii AS3.277[J]. Journal of Microbiological Methods, 2010, 83: 74－81. 4、β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化PD生成產(chǎn)物的HPLC鑒定 [1] 田天麗, 沈競, 徐萌萌, 王敬, 孫啟玲. 虎杖中虎杖苷的微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化研究[J].四川大學(xué)學(xué)報, 2008, 45（2）: 438-440.
同類課題研究水平概述
- 1、袁潤蕾的論文（時珍國醫(yī)國藥，2008）利用一株根霉菌株T34對10%虎杖苷粗提物進行液態(tài)發(fā)酵，使虎杖苷轉(zhuǎn)化成白藜蘆醇，采用薄層色譜法確定在優(yōu)化發(fā)酵條件下轉(zhuǎn)化時間為26. 8 h，通過高效液相色譜法證明虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，轉(zhuǎn)化率達95.8%。 2、田天麗的論文（四川大學(xué)學(xué)報，2008）從中藥材虎杖中篩選到一株具有轉(zhuǎn)化虎杖苷能力的根霉菌株T234，利用該菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶能將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，轉(zhuǎn)化率達98%。
