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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 高產(chǎn)青霉菌株BM16-3的纖維素酶特性的鑒定及纖維二糖水解酶基因的克隆
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本作品通過以微晶纖維素(Avicel)為唯一碳源，從自然環(huán)境分離篩選到具有微晶纖維素(Avicel)降解能力的青霉，通過對(duì)其所產(chǎn)纖維素酶特性的研究，從中獲得產(chǎn)高酶活力纖維素酶的青霉，同時(shí)對(duì)纖維二糖水解酶基因進(jìn)行克隆，為提高纖維素的降解效率，獲得高比活力的纖維素酶奠定基礎(chǔ)，為下一步分子改造提供材料，為進(jìn)一步提高纖維素酶比活力提供參考，從而為研發(fā)以纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇用纖維素酶提供基因資源。
- 詳細(xì)介紹：
- 從采自山口紅樹林、白馬雪山、東北的原始森林土壤中分離篩選到47株青霉，用Avicel作為唯一碳源、pH5.0的培養(yǎng)基平板在28℃培養(yǎng)72h后分離得到單菌落，經(jīng)剛果紅染色后，通過比較透明圈的透明程度和大小初步篩選出能夠降解結(jié)晶纖維素的青霉菌株。再用Avicel作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)初篩所得的菌株，誘導(dǎo)產(chǎn)酶后，取上清液，用DNS法測(cè)定菌株所產(chǎn)生的纖維素酶粗酶液水解Avicel底物的最適pH及最適溫度以及最高酶活力。 發(fā)現(xiàn)青霉菌株SK9-1, DB1-2, BM16-3, BM1-2的酶活相對(duì)較高，分別達(dá)到0.302 IU/mL， 0.295 IU/mL， 0.323 IU/mL， 0.282 IU/mL，該四株青霉菌株纖維素酶的最適作用溫度分別為55℃，45℃，50℃，40-45℃，最適作用pH值分別為4.5，4.5-5.0，5.0，5.0。BM16-3在其產(chǎn)酶的最適條件下，酶活最高，選作進(jìn)一步研究。通過對(duì)青霉菌株BM16-3產(chǎn)纖維素酶水解Avicel產(chǎn)物的TLC分析，發(fā)現(xiàn)BM16-3纖維素酶作用Avicel所產(chǎn)葡萄糖量隨作用時(shí)間延長而增多，24 h后產(chǎn)生大量葡萄糖和微量纖維二糖。推測(cè)BM16-3纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶，具有完整的纖維素酶系統(tǒng)。結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)觀察及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)序列同源性比對(duì)結(jié)果，將菌株BM16-3初步鑒定為草酸青霉(Penicillium oxalicum)。 用PCR的方法，根據(jù)已知同源纖維素酶的基因序列設(shè)計(jì)引物克隆了菌株BM16-3的纖維二糖水解酶基因cbh1，經(jīng)分析該基因序列的長度為1614 bp，編碼537個(gè)氨基酸，與已發(fā)表的草酸青霉F67（GeneBank登錄號(hào)：EU727171）纖維二糖水解酶Ⅰ基因序列同源性為98.1%。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：本實(shí)驗(yàn)以高產(chǎn)青霉菌株為材料，為提高纖維素的降解效率，獲得高比活力的纖維素酶奠定基礎(chǔ)，為下一步分子改造提供材料，為進(jìn)一步提高纖維素酶比活力提供參考，從而為研發(fā)以纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇用纖維素酶提供基因資源。 基本思路：通過對(duì)已分離篩選出的多株青霉菌株進(jìn)行形態(tài)觀察等多種菌種鑒定方法及纖維素酶學(xué)特性的鑒定，篩選出最有應(yīng)用潛力的菌株進(jìn)行纖維二糖水解酶基因的克隆，并對(duì)該基因進(jìn)行分析。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 科學(xué)性：本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)路線是青霉菌株的篩選；產(chǎn)酶特性分析；酶活力高，特性好青霉菌株的鑒定；克隆并分析纖維素酶基因。 先進(jìn)性：相對(duì)于木霉菌，目前對(duì)青霉的纖維素酶基因研究相對(duì)較少，獲得的基因?qū)⒂糜诶w維素酶分子的改造，對(duì)于豐富微生物降解纖維素的認(rèn)識(shí)具有重要作用。 獨(dú)特之處：本工作對(duì)青霉菌產(chǎn)生纖維素酶的研究發(fā)現(xiàn)該酶系降解纖維素產(chǎn)生較多的葡萄糖而不是纖維二糖，這種完善的纖維素酶酶系具有很高的研究價(jià)值。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 實(shí)際應(yīng)用價(jià)值：通過青霉菌株的篩選及鑒定工作，得到了酶活力高達(dá)0.323 IU/mL，最適pH值5.0、最適溫度50℃的青霉菌株，同時(shí)克隆得到纖維二糖水解酶基因，為進(jìn)一步進(jìn)行菌種改造和纖維素酶基因的人工改造提供材料，進(jìn)而滿足工業(yè)應(yīng)用的要求。 現(xiàn)實(shí)意義：本作品從分離篩選到青霉菌株中的酶活力高、酶學(xué)性質(zhì)好青霉菌株，并從中克隆鑒定纖維素酶基因，為研發(fā)以纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇用纖維素酶提供基因資源。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 從采自山口紅樹林、白馬雪山、東北的樣品中分離篩選到47株青霉，用Avicel作為唯一碳源，pH5.0的培養(yǎng)基在28℃培養(yǎng)72h分離得到單菌落，經(jīng)剛果紅染色后通過透明圈的透明程度和大小初步篩選出能夠降解結(jié)晶纖維素的青霉菌株。再用Avicel作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)初篩所得的菌株，誘導(dǎo)產(chǎn)酶后，取上清液對(duì)CMC及Avicel底物用DNS法測(cè)定菌株的所產(chǎn)生的纖維素酶粗酶的最適pH及最適溫度以及最高酶活力，再根據(jù)用同步糖化共發(fā)酵工藝生產(chǎn)乙醇對(duì)纖維素酶特性的要求，綜合評(píng)比出最合適、有繼續(xù)研究價(jià)值的菌株，并對(duì)其進(jìn)行分類鑒定。再采用RT-PCR的方法，根據(jù)已知同源纖維素酶的基因序列設(shè)計(jì)引物克隆其纖維二糖水解酶基因，并對(duì)該基因進(jìn)行分析。 關(guān)鍵詞 青霉 纖維素酶 RT-PCR 克隆
獲獎(jiǎng)情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- [1] Zhang Y-HP, Himmel ME, Mielenz JR (2006) Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnol Advan 24:452-481 [2] Teeri TT (1997) Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolase. Trends Biotechnol 15(5): 160-167 [3] Lynd LR, Weimer PJ, Willem HZ, et al. (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev 66:506-577 [4] Henrissat B (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J 280: 309-316 [5] Hong J, Tamaki H, Yamamoto K, et al. Cloning of a gene encoding thermostable cellobiohydrolase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 63 (1): 42-50 [6] Juhasz T, Kozma K, Szengyel Z, et al. Production of β-glucosidase in mixed culture of Aspergillus niger BKMF 1305 and Trichoderma reesei RUTC30[J]. Food Technol Biotechnol, 2003, 41 (1): 49-53
同類課題研究水平概述
- 由于能源的短缺問題刺激了各國研究生物質(zhì)能源，使得燃料乙醇研究迅猛發(fā)展，其中以美國和巴西的研究最有代表性。 我們知道直接用谷物，甘蔗等作物生產(chǎn)燃料乙醇的技術(shù)十分成熟和便利，但是也存在巨大的缺陷——與人畜爭奪糧食。對(duì)于我國這樣一個(gè)人口眾多，土地資源短缺，糧食是極其重要的戰(zhàn)略資源的國家來說，單純靠糧食淀粉發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是不現(xiàn)實(shí)的。 因此，利用非糧作物發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇應(yīng)該是我國的重點(diǎn)。我國的纖維素資源極其豐富，農(nóng)作物秸稈的年產(chǎn)量列世界之首；每年生產(chǎn)的工業(yè)纖維素廢渣數(shù)千萬噸；適合于種植林草的荒地、荒山面積巨大等等都可以專門用作能源作物的生產(chǎn)，這些對(duì)于發(fā)展以非糧作物為原料的燃料乙醇極為有利。 植物纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇主要有兩條途徑——熱裂解和生物轉(zhuǎn)化。纖維素生產(chǎn)燃料乙醇目前最先進(jìn)最有效的方法是酶法發(fā)酵，但是同樣面臨很多問題：（1）原料分布分散、收集成本高（2）天然纖維素原料的結(jié)構(gòu)性質(zhì)非常復(fù)雜，纖維素的高度結(jié)晶性和木質(zhì)化，阻礙了酶與纖維素的接觸，使其難以被生物降解。所以，為提高酶解效率必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理。（3）目前用于纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶比活力普遍較低、成本較高，這也妨礙了木質(zhì)纖維素資源酶法生物技術(shù)轉(zhuǎn)化的實(shí)用化。（4）總量占植物纖維素10-40％的半纖維素水解產(chǎn)物含有大量的五碳糖，而這些戊糖一般不能被通常的釀酒酵母發(fā)酵為乙醇，這也會(huì)使乙醇的得率大大降低。 在酶法發(fā)酵過程中，不溶于水且纖維素酶不易接近的纖維素原料需要經(jīng)過預(yù)處理后再用纖維素酶等酶解糖化共發(fā)酵，然后用酵母發(fā)酵工藝生產(chǎn)乙醇，產(chǎn)物經(jīng)分離純化后即獲得成品燃料乙醇。利用纖維素資源生產(chǎn)燃料乙醇的生產(chǎn)過程中最為關(guān)鍵，也是反應(yīng)限速步驟的纖維素水解過程要靠纖維素酶來完成。 因此，纖維素酶的研究在以纖維素為原料的燃料乙醇的生產(chǎn)過程中具有重要的意義。 對(duì)于纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇來說，纖維素酶特別是內(nèi)、外切葡聚糖酶的水解效率是降低生產(chǎn)成本、影響燃料乙醇推廣的關(guān)鍵因素。在自然界中纖維素酶主要是在細(xì)菌、真菌以及食草動(dòng)物的瘤胃中，本項(xiàng)目是從篩選得到的酶活力高、酶學(xué)性質(zhì)好的青霉菌中克隆鑒定纖維素酶基因，為研發(fā)以纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇提供基因資源。
