基本信息
- 項目名稱：
- 新型丙型肝炎病毒定量PCR檢測試劑盒的研制
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 我們設(shè)計了一類新型二聚體突變引物，實現(xiàn)的探針的單標記，克服了Taqman探針技術(shù)成本高、檢測時間較長的缺點。采用該技術(shù)進行了丙型HCV定量檢測，并進行了方法學評價以及與Taqman探針技術(shù)進行了方法對比，數(shù)據(jù)顯示本試劑盒的檢測性能達到了現(xiàn)今同類產(chǎn)品的水平，在檢測成本和檢測時間上有明顯優(yōu)勢。
- 詳細介紹：
- 我們研發(fā)了一類新型二聚體熒光突變引物，將熒光報告基團標記在引物上，而淬滅基團標記在與熒光引物互補的寡核苷酸鏈上，即兩條互補的寡核苷酸只分別標記了相應(yīng)的淬滅或者報告基團。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計可巧妙地回避對淬滅鏈末端進行封閉，因為它雖與引物互補，而3’端已被淬滅基團阻斷，而PCR不能從5’端延伸，所以不需要對5’端進行磷酸化阻斷；而引物僅5’端標記了熒光報告基團，引物與靶基因結(jié)合后，可從3’端延伸完成靶基因復(fù)制。這樣，實現(xiàn)了真正的單標記結(jié)構(gòu)，故合成、純化簡單且成本低，克服了普通多標記探針法成本高的難題。此外，為達到根據(jù)real-time PCR原理，準確定量的目的，我們在和熒光引物互補的淬滅鏈序列中，人為設(shè)計一個堿基突變。無靶基因時，兩者將相互結(jié)合產(chǎn)生FRET，不會發(fā)射熒光。一旦標本中存在靶基因，由于熒光引物與靶基因完全互補，而淬滅鏈存在1個突變堿基，所以在較高溫度下，熒光引物與靶基因的親和力大于與淬滅鏈間的親和力，從而優(yōu)先和靶基因結(jié)合，在PCR體系中發(fā)揮普通引物引導(dǎo)延伸的功能，標記的熒光基團隨引物整合在新生PCR產(chǎn)物中起探針的指示作用，即所有新生PCR產(chǎn)物均被熒光基團標記。此時，F(xiàn)RET被破壞，忠實反映PCR產(chǎn)物量的熒光信號可被實時定量檢測。根據(jù)上述分析，從理論上說應(yīng)用我們建立的這一檢測系統(tǒng)，根據(jù)擴增時熒光信號的增加，可準確進行基因定量。并且，由于引物具有高度特異性，產(chǎn)生的熒光信號也是高度特異的，既具備探針法的特異性，而又不用單獨設(shè)計熒光標記的探針，同時又具有染料法設(shè)計簡單、價廉的優(yōu)點。目前熒光定量PCR儀已在醫(yī)院廣泛應(yīng)用，該系統(tǒng)可直接在臨床檢驗中推廣應(yīng)用。因此，新型二聚體熒光突變引物具有精確定量、標記簡單、成本低廉的優(yōu)點，符合臨床檢測方法要求的可靠、實用兩大原則，將其開發(fā)成高通用性，易于推廣普及的核酸定量技術(shù)，可在感染性疾病、腫瘤、遺傳疾病、基因表達等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。在感染性疾病的臨床檢測中，定量PCR技術(shù)多用于一些臨床培養(yǎng)難以開展或者培養(yǎng)周期較長的病原體，如：各種病毒、結(jié)核分枝桿菌、支原體、沙眼衣原體等，也有用于耐藥基因檢測的報道。本研究中，我們擬選擇HCV為研究對象，通過與其它臨床檢測方法比較和方法學評價，對基于新型二聚體突變引物的熒光定量PCR技術(shù)，進行系統(tǒng)的方法學評價，證實其可行性，并探討其臨床應(yīng)用價值。
作品專業(yè)信息
設(shè)計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標
- 熒光定量PCR的定量技術(shù)多種多樣，主要分為熒光染料技術(shù)和熒光探針技術(shù)。熒光染料技術(shù)特異性不高，熒光探針技術(shù)雖然特異性好，但是常用的Taqman探針技術(shù)主要存在兩大問題：一是在探針的兩端標記兩個熒光基團，標記和純化難度高；二是Taqman探針的發(fā)光需要Taq酶的水解作用，對Taq酶的要求高，反應(yīng)時間較長。我們研發(fā)了一類新型二聚體熒光突變引物，將熒光報告基團標記在引物上，而淬滅基團標記在與熒光引物互補的寡核苷酸鏈上，即兩條寡核苷酸只分別標記了相應(yīng)的淬滅或者報告基團。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計巧妙地回避了對淬滅鏈末端進行封閉，因為它雖與引物互補，而3’端已被淬滅基團阻斷，而PCR不能從5’端延伸，所以不需要對5’端進行磷酸化阻斷；5’端標記了熒光報告基團的引物與靶基因結(jié)合后，可從3’端延伸完成復(fù)制。并且應(yīng)用到丙型肝炎病毒（HCV）定量檢測中。
科學性、先進性
- 本項目以熒光共振能量轉(zhuǎn)移為理論基礎(chǔ)，基于該基礎(chǔ)開發(fā)的各種探針技術(shù)，在科研和臨床診斷中已廣泛應(yīng)用，從理論講，本項目設(shè)計思想是可行的。首次提出新型二聚體熒光突變引物，以及基于此建立新型real-time PCR系統(tǒng)的科學設(shè)想。其既有探針法特異性高的優(yōu)點，又克服了其設(shè)計復(fù)雜、合成成本高的難題，為real-time PCR技術(shù)進行定量檢測提供了新思路和新方法。本項目不僅學術(shù)思想創(chuàng)新性強、密切結(jié)合臨床需求，具有較高的科學性和社會價值，而且可直接轉(zhuǎn)化開發(fā)，生產(chǎn)具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的商品化試劑盒，打破國外壟斷，創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- 2011年5月，海南省大學生“挑戰(zhàn)杯”決賽二等獎。
作品所處階段
- 臨床初步試用檢測階段。
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 整體有償轉(zhuǎn)讓。
作品可展示的形式
- 可在墻報或以論文形式展示。
使用說明,技術(shù)特點和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟效益預(yù)測
- 1.結(jié)構(gòu)上具有天然的“熱啟動”功能，增加了方法的特異性； 2.熒光報告基團和淬滅基團空間距離近，報告基團可被有效抑制，降低了方法的本底，一旦擴增開始兩者便徹底分離，產(chǎn)生的熒光信號強，增加了方法的靈敏度； 3.真正實現(xiàn)熒光探針的單標記，降低了合成、純化難度，因此降低了成本。 4.二聚體突變引物可采用快循環(huán)，根據(jù)PCR速度最快，而不影響熒光曲線的原則選擇循環(huán)參數(shù)。 5.具有高通用性，可在國產(chǎn)和進口定量PCR儀上使用。 可用于所有核酸定量檢測，可在腫瘤、遺傳疾病、感染性疾病、基因表達等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。與目前市場上廣泛使用的TaMan技術(shù)相比具有成本低、檢測時間短的優(yōu)勢，可產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益。
同類課題研究水平概述
- 實時聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)分為內(nèi)摻式染料技術(shù)和探針技術(shù)兩類。內(nèi)摻式染料技術(shù)方法簡單，成本較低，但特異性差，故不適于臨床檢測。探針技術(shù)采用了基于熒光淬滅原理或熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）的探針，包括TaqMan探針、Amplifluor探針、分子信標、蝎型探針等。這些探針均是在與模板互補的同一寡核苷酸鏈上，分別標記熒光基團和淬滅基團，特異性高，定量準確，因而被廣泛應(yīng)用于臨床診斷中。但這些探針均屬于多標記探針，其合成難度和成本較高，制約了其推廣應(yīng)用。不少研究人員試圖采用單標記探針來降低合成難度和成本，如雜交探針（hybridization probes）和熒光置換探針（displacing probes），取得了較好效果。但為防止探針與靶序列雜交引起自身延伸而被破壞，仍然需要在探針末端磷酸化來阻斷其延伸，因此，并非真正意義的單標記探針技術(shù)?；谏鲜龇治?，本課題設(shè)計了一種全新的二聚體突變引物，其具有獨特的結(jié)構(gòu)，為真正意義的單標記探針。與其它多標記熒光探針相比，二聚體突變引物有以下優(yōu)點： 1. 結(jié)構(gòu)上具有天然的“熱啟動”功能，增加了方法的特異性； 2. 熒光報告基團和淬滅基團空間距離近，報告基團可被有效抑制，降低了方法的本底，一旦擴增開始兩者便徹底分離，產(chǎn)生的熒光信號強，增加了方法的靈敏度； 3. 真正實現(xiàn)熒光探針的單標記，降低了合成、純化難度，因此降低了成本。這種新型定量檢測系統(tǒng)既具有染料法對新生雙鏈DNA均能示蹤、成本低的特點，又具有探針法高特異性，是一種高通用性、高特異性和靈敏性、操作簡單、價廉的新型real-time PCR技術(shù)。
