基本信息
- 項目名稱：
- 中華鱉群體死亡癥二價基因工程緩釋疫苗的研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術(shù)論文
- 簡介：
- 本研究構(gòu)建了融合質(zhì)粒pET-ompA-hly，轉(zhuǎn)化受體菌BL21（DE3），獲得了陽性重組菌株BL21（DE3）（pET-ompA-hly）。誘導陽性重組菌株目的基因表達，制備二價基因工程疫苗。將表達的目的蛋白與PLGA材料混合乳化，制備微球。通過優(yōu)化制備條件，檢測包封率和體外釋放時間，進行動物免疫實驗，檢測二價基因工程緩釋疫苗的保護率及其體內(nèi)釋放效果。為制備中華鱉群體死亡癥基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
- 詳細介紹：
- 中華鱉是我國淡水養(yǎng)殖名優(yōu)品種之一，具有良好的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值和藥用價值。但近幾年來，特種水產(chǎn)養(yǎng)殖尤其是養(yǎng)鱉業(yè)迅猛發(fā)展，高密度人工養(yǎng)鱉業(yè)中鱉病肆虐發(fā)生, 如紅脖子病、紅底板病、白底板病、穿孔病、疥瘡病等。2008年4月在石家莊地區(qū)暴發(fā)了中華鱉群體死亡，鱉體沒有明顯病癥，病死鱉經(jīng)解剖觀察可見其肝腫大，呈土黃色，有出血點。但其致死原因不明，而且死亡率很高，給養(yǎng)殖戶造成了嚴重的經(jīng)濟損失。 經(jīng)大量報道表明，中華鱉常見的傳染性疾病多由氣單胞菌屬的病原菌導致。嗜水氣單胞菌是在同一水體環(huán)境中的水生生物中分離出的最常見的病原菌之一，維氏氣單胞菌是于2007年由本實驗室從發(fā)生群體死亡的病鱉體內(nèi)分離鑒定出來的致病菌。兩者的主要致病因子包括外膜蛋白、S層蛋白、內(nèi)毒素、外毒素、胞外酶、鐵轉(zhuǎn)運蛋白等。外膜蛋白等生物被膜結(jié)構(gòu)可使病原菌吸附于宿主細胞，從而激發(fā)機體的細胞免疫和體液免疫應答，具有良好的免疫原性。外毒素可造成宿主細胞不同毒性而致病，并且已有報道證實外毒素中的溶血素具有三種毒性，這在免疫學上具有重要意義。因此，這兩種蛋白可做為候選抗原。本實驗擴增維氏氣單胞菌的外膜蛋白ompA基因及嗜水氣單胞菌的hly毒素基因，構(gòu)建融合質(zhì)粒并進行表達，制備基因工程二價疫苗并研究其免疫原性。本研究根據(jù)GenBank報道的維氏氣單胞菌ompA基因序列和嗜水氣單胞菌hly基因序列，分別設(shè)計了兩對引物，PCR擴增得到ompA和hly基因。將ompA和hly兩個基因融合后與PET-28a連接，得到重組質(zhì)粒pET-ompA-hly，轉(zhuǎn)化受體菌BL21(DE3)，得到重組菌株BL21(DE3) (pET-ompA-hly)，通過SDS-PAGE和Western blot分析ompA-hly融合蛋白的表達情況，采用生物可降解高分子材料PLGA，通過W/O/W法制備口服緩釋微球，并對制備工藝進行初步優(yōu)化。采用微球?qū)蚬こ叹闎L21(DE3)(pET-omp-hly)包封后進行動物保護性實驗。結(jié)果表明：PCR擴增得到了ompA和hly基因，序列分析結(jié)果表明，ompA和hly基因片段大小分別為1000bp和1500bp，與參考序列同源性分別為97.45%和96.58%。重組蛋白得到了高效表達，ompA-hly融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的 26.3%，Western blot分析表明表達的目的蛋白為特異性產(chǎn)物。微球制備得到包封率為68.8%，外觀較好的微球。免疫動物實驗結(jié)果表明基因工程菌株具有較好的免疫保護效果保護率高達100%，抗體效價為1：1600。經(jīng)微球口服免疫的保護率高達95%，抗體水平較高并且免疫期較長，二免后40d抗體依然呈陽性。本研究成功制備了ompA-hly二價基因工程緩釋候選疫苗，口服使用安全，具有較高的抗體水平及較長的免疫期。為預防中華鱉群體死亡癥找到一種安全、快捷、有效的免疫預防途徑。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 撰寫目的：本實驗結(jié)合基因工程疫苗和緩釋制劑制備成二價基因工程緩釋疫苗，采用口服免疫的方法使實驗動物獲得免疫，旨在找到一種安全、有效、便捷的防治中華鱉群體死亡癥的途徑。 基本思路：1、構(gòu)建融合質(zhì)粒pET-ompA-hly，轉(zhuǎn)化受體菌BL2進行誘導表達和條件優(yōu)化并檢測。 2、制備二價基因工程疫苗，進行動物保護性實驗，測免疫原性 。 3、制備微球，優(yōu)化制備條件。檢測包封率、體外釋放時間及保護結(jié)果。
科學性、先進性及獨特之處
- 1、進行二價基因工程疫苗的研究，使制備的疫苗能同時防治兩種致病菌，即維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌。 2、使用PLGA作為包封材料，可使藥物按一定規(guī)律緩釋，使藥物在體內(nèi)較長時間能保持有效藥物濃度，達到減少藥物總劑量，提高藥效，延長作用時間和減少副反應的目的。 3、研究檢測口服微球緩釋二價基因工程疫苗的免疫保護率、效價和保護期。為預防中華鱉群體死亡癥找到一種安全、快捷、有效的免疫預防途徑。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 將引發(fā)疾病的兩種病原菌分別提取保護性抗原基因，并連接在同一個表達載體上，制備二價基因工程疫苗，使制得的一支疫苗可以同時防治兩種病原菌的感染?？诜巹┦褂帽憬?、安全，毒副作用小。用生物降解高分子材料制備包封率高、載藥率高和制劑穩(wěn)定性較高的生物藥劑正成為藥物研究的主流方向。免疫疫苗口服劑型的研制成功, 將是防治鱉類疾病研究的一次重大突破,為鱉類疾病預防提供新的途徑，具有重要的理論價值和應用前景。
學術(shù)論文摘要
- 將ompA和hly兩個基因融合后與PET-28a連接，得到重組質(zhì)粒pET-ompA-hly，轉(zhuǎn)化受體菌BL21(DE3)，得到重組菌株BL21(DE3) (pET-ompA-hly)，通過SDS-PAGE和Western blot分析ompA-hly融合蛋白的表達情況，采用生物可降解高分子材料PLGA，通過W/O/W法制備口服緩釋微球，并對制備工藝進行初步優(yōu)化。采用微球?qū)蚬こ叹闎L21(DE3)(pET-omp-hly)包封后進行動物保護性實驗。結(jié)果表明：重組蛋白得到了高效表達，ompA-hly融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的 26.3%，Western blot分析表明表達的目的蛋白為特異性產(chǎn)物。微球制備得到包封率為68.8%，外觀較好的微球。免疫動物實驗結(jié)果表明基因工程菌株具有較好的免疫保護效果保護率高達100%，抗體效價為1：1600。經(jīng)微球口服免疫的保護率高達95%，抗體水平較高并且免疫期較長，二免后40d抗體依然呈陽性。本研究成功制備了ompA-hly二價基因工程緩釋候選疫苗，口服使用安全，具有較高的抗體水平及較長的免疫期。
獲獎情況
- 2011年校級科技創(chuàng)新競賽 特等獎 2011年省挑戰(zhàn)杯大學生課外學生科技作品競賽一等獎 本研究的相關(guān)內(nèi)容被《XX學報》接收，將在2011年7月發(fā)表于在2011年第4期上（見附件）。
鑒定結(jié)果
- pET-ompA-hly融合質(zhì)粒表達及基因工程二價菌株構(gòu)建組織切片驗證電鏡微球呈規(guī)則圓球狀，表面較光滑體外釋放結(jié)果顯示，微球體外釋放可持續(xù)30天動物免疫保護性實驗結(jié)果表明保護率較高
參考文獻
- [1]錢明明,趙寶華等.中華鱉常見疾病的診斷及其綜合防治[J].動物醫(yī)學進展,2009,30(4):103-107. [2] Reyes-Sandoval A, Ertl HC. DNA vaccines[J]. Curr Mol Med, 2001, 1: 217-243. [3] Caipang CMA, Takano T, et al. Genetic vaccines protect red seabream, Pagrus major, upon challenge with red seabream iridovirus (RSIV)[J]. Fish Shellfish Immunol, 2006, 21: 130-138. [4] Giudice EL, Campbell JD. Needle-free vaccine delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2006, 58: 68-89. [5] Mittal SK. Aggarwal N, Sailaja G, van Olphen A, et al. Immunization with DNA, adenovirus or both in biodegradable alginate microspheres: effect of route of inoculation on immune response[J]. Vaccine, 2001, 19: 253-263.
同類課題研究水平概述
- 在我國，中華鱉的人工養(yǎng)殖只有幾十年的歷史，盡管發(fā)展迅速，但對于中華鱉的研究不夠完善，主要集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生態(tài)分布、生長繁殖、養(yǎng)殖管理等方面。雖然在中華鱉疾病防治的研究上取得了一定的進展, 但在免疫防護、病害的預測和預報以及健康養(yǎng)殖模式上還有待于進一步深入研究。尤其在最近幾年，促進中華鱉健康及疾病的預防已成為增加養(yǎng)殖效率的焦點問題，而免疫接種法防治鱉病是最積極有效的方法之一。目前，許多國家已經(jīng)制備出了基因工程疫苗，并在實際中應用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，歐、美、日本等已成功地將弧菌、產(chǎn)氣單胞菌、愛德華氏菌等魚類病原菌制備成全細胞滅活疫苗，并且用從菌體中提取的脂多糖、胞外蛋白等有效抗原，制備出的單克隆抗體等生物工程疫苗并已商業(yè)化生產(chǎn)。中華鱉氣單胞菌疫苗研究也已有不少報道,但由于免疫效果差或使用不方便等原因,這些疫苗的推廣應用受到限制。為此,本實驗將采用可生物降解的高分子聚合物為載體,研制口服緩釋微球疫苗。 國外是在50年代開始研制口服緩釋、控釋制劑,70年代被醫(yī)學界認可上市的藥物品種逐漸增多。國外上市的口服緩釋制劑藥物品種已有200余種,不同規(guī)格的商品計有400種以上。而在國內(nèi)，口服藥物緩釋技術(shù)的研制尚屬起步階段，僅孫紅祥等采用生物降解性高分子聚合物為載體，研制了口服緩釋微球滅活疫苗，并作了相關(guān)報道。
