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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 中華鱉群體死亡癥二價(jià)基因工程緩釋疫苗的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本研究構(gòu)建了融合質(zhì)粒pET-ompA-hly，轉(zhuǎn)化受體菌BL21（DE3），獲得了陽(yáng)性重組菌株BL21（DE3）（pET-ompA-hly）。誘導(dǎo)陽(yáng)性重組菌株目的基因表達(dá)，制備二價(jià)基因工程疫苗。將表達(dá)的目的蛋白與PLGA材料混合乳化，制備微球。通過優(yōu)化制備條件，檢測(cè)包封率和體外釋放時(shí)間，進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)二價(jià)基因工程緩釋疫苗的保護(hù)率及其體內(nèi)釋放效果。為制備中華鱉群體死亡癥基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 中華鱉是我國(guó)淡水養(yǎng)殖名優(yōu)品種之一，具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。但近幾年來，特種水產(chǎn)養(yǎng)殖尤其是養(yǎng)鱉業(yè)迅猛發(fā)展，高密度人工養(yǎng)鱉業(yè)中鱉病肆虐發(fā)生, 如紅脖子病、紅底板病、白底板病、穿孔病、疥瘡病等。2008年4月在石家莊地區(qū)暴發(fā)了中華鱉群體死亡，鱉體沒有明顯病癥，病死鱉經(jīng)解剖觀察可見其肝腫大，呈土黃色，有出血點(diǎn)。但其致死原因不明，而且死亡率很高，給養(yǎng)殖戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 經(jīng)大量報(bào)道表明，中華鱉常見的傳染性疾病多由氣單胞菌屬的病原菌導(dǎo)致。嗜水氣單胞菌是在同一水體環(huán)境中的水生生物中分離出的最常見的病原菌之一，維氏氣單胞菌是于2007年由本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)生群體死亡的病鱉體內(nèi)分離鑒定出來的致病菌。兩者的主要致病因子包括外膜蛋白、S層蛋白、內(nèi)毒素、外毒素、胞外酶、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。外膜蛋白等生物被膜結(jié)構(gòu)可使病原菌吸附于宿主細(xì)胞，從而激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性。外毒素可造成宿主細(xì)胞不同毒性而致病，并且已有報(bào)道證實(shí)外毒素中的溶血素具有三種毒性，這在免疫學(xué)上具有重要意義。因此，這兩種蛋白可做為候選抗原。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增維氏氣單胞菌的外膜蛋白o(hù)mpA基因及嗜水氣單胞菌的hly毒素基因，構(gòu)建融合質(zhì)粒并進(jìn)行表達(dá)，制備基因工程二價(jià)疫苗并研究其免疫原性。本研究根據(jù)GenBank報(bào)道的維氏氣單胞菌ompA基因序列和嗜水氣單胞菌hly基因序列，分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，PCR擴(kuò)增得到ompA和hly基因。將ompA和hly兩個(gè)基因融合后與PET-28a連接，得到重組質(zhì)粒pET-ompA-hly，轉(zhuǎn)化受體菌BL21(DE3)，得到重組菌株BL21(DE3) (pET-ompA-hly)，通過SDS-PAGE和Western blot分析ompA-hly融合蛋白的表達(dá)情況，采用生物可降解高分子材料PLGA，通過W/O/W法制備口服緩釋微球，并對(duì)制備工藝進(jìn)行初步優(yōu)化。采用微球?qū)蚬こ叹闎L21(DE3)(pET-omp-hly)包封后進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增得到了ompA和hly基因，序列分析結(jié)果表明，ompA和hly基因片段大小分別為1000bp和1500bp，與參考序列同源性分別為97.45%和96.58%。重組蛋白得到了高效表達(dá)，ompA-hly融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的 26.3%，Western blot分析表明表達(dá)的目的蛋白為特異性產(chǎn)物。微球制備得到包封率為68.8%，外觀較好的微球。免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因工程菌株具有較好的免疫保護(hù)效果保護(hù)率高達(dá)100%，抗體效價(jià)為1：1600。經(jīng)微球口服免疫的保護(hù)率高達(dá)95%，抗體水平較高并且免疫期較長(zhǎng)，二免后40d抗體依然呈陽(yáng)性。本研究成功制備了ompA-hly二價(jià)基因工程緩釋候選疫苗，口服使用安全，具有較高的抗體水平及較長(zhǎng)的免疫期。為預(yù)防中華鱉群體死亡癥找到一種安全、快捷、有效的免疫預(yù)防途徑。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 撰寫目的：本實(shí)驗(yàn)結(jié)合基因工程疫苗和緩釋制劑制備成二價(jià)基因工程緩釋疫苗，采用口服免疫的方法使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得免疫，旨在找到一種安全、有效、便捷的防治中華鱉群體死亡癥的途徑。 基本思路：1、構(gòu)建融合質(zhì)粒pET-ompA-hly，轉(zhuǎn)化受體菌BL2進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化并檢測(cè)。 2、制備二價(jià)基因工程疫苗，進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，測(cè)免疫原性 。 3、制備微球，優(yōu)化制備條件。檢測(cè)包封率、體外釋放時(shí)間及保護(hù)結(jié)果。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1、進(jìn)行二價(jià)基因工程疫苗的研究，使制備的疫苗能同時(shí)防治兩種致病菌，即維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌。 2、使用PLGA作為包封材料，可使藥物按一定規(guī)律緩釋，使藥物在體內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間能保持有效藥物濃度，達(dá)到減少藥物總劑量，提高藥效，延長(zhǎng)作用時(shí)間和減少副反應(yīng)的目的。 3、研究檢測(cè)口服微球緩釋二價(jià)基因工程疫苗的免疫保護(hù)率、效價(jià)和保護(hù)期。為預(yù)防中華鱉群體死亡癥找到一種安全、快捷、有效的免疫預(yù)防途徑。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 將引發(fā)疾病的兩種病原菌分別提取保護(hù)性抗原基因，并連接在同一個(gè)表達(dá)載體上，制備二價(jià)基因工程疫苗，使制得的一支疫苗可以同時(shí)防治兩種病原菌的感染。口服藥劑使用便捷、安全，毒副作用小。用生物降解高分子材料制備包封率高、載藥率高和制劑穩(wěn)定性較高的生物藥劑正成為藥物研究的主流方向。免疫疫苗口服劑型的研制成功, 將是防治鱉類疾病研究的一次重大突破,為鱉類疾病預(yù)防提供新的途徑，具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 將ompA和hly兩個(gè)基因融合后與PET-28a連接，得到重組質(zhì)粒pET-ompA-hly，轉(zhuǎn)化受體菌BL21(DE3)，得到重組菌株BL21(DE3) (pET-ompA-hly)，通過SDS-PAGE和Western blot分析ompA-hly融合蛋白的表達(dá)情況，采用生物可降解高分子材料PLGA，通過W/O/W法制備口服緩釋微球，并對(duì)制備工藝進(jìn)行初步優(yōu)化。采用微球?qū)蚬こ叹闎L21(DE3)(pET-omp-hly)包封后進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：重組蛋白得到了高效表達(dá)，ompA-hly融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的 26.3%，Western blot分析表明表達(dá)的目的蛋白為特異性產(chǎn)物。微球制備得到包封率為68.8%，外觀較好的微球。免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因工程菌株具有較好的免疫保護(hù)效果保護(hù)率高達(dá)100%，抗體效價(jià)為1：1600。經(jīng)微球口服免疫的保護(hù)率高達(dá)95%，抗體水平較高并且免疫期較長(zhǎng)，二免后40d抗體依然呈陽(yáng)性。本研究成功制備了ompA-hly二價(jià)基因工程緩釋候選疫苗，口服使用安全，具有較高的抗體水平及較長(zhǎng)的免疫期。
獲獎(jiǎng)情況
- 2011年校級(jí)科技創(chuàng)新競(jìng)賽 特等獎(jiǎng) 2011年省挑戰(zhàn)杯大學(xué)生課外學(xué)生科技作品競(jìng)賽一等獎(jiǎng) 本研究的相關(guān)內(nèi)容被《XX學(xué)報(bào)》接收，將在2011年7月發(fā)表于在2011年第4期上（見附件）。
鑒定結(jié)果
- pET-ompA-hly融合質(zhì)粒表達(dá)及基因工程二價(jià)菌株構(gòu)建組織切片驗(yàn)證電鏡微球呈規(guī)則圓球狀，表面較光滑體外釋放結(jié)果顯示，微球體外釋放可持續(xù)30天動(dòng)物免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明保護(hù)率較高
參考文獻(xiàn)
- [1]錢明明,趙寶華等.中華鱉常見疾病的診斷及其綜合防治[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(4):103-107. [2] Reyes-Sandoval A, Ertl HC. DNA vaccines[J]. Curr Mol Med, 2001, 1: 217-243. [3] Caipang CMA, Takano T, et al. Genetic vaccines protect red seabream, Pagrus major, upon challenge with red seabream iridovirus (RSIV)[J]. Fish Shellfish Immunol, 2006, 21: 130-138. [4] Giudice EL, Campbell JD. Needle-free vaccine delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2006, 58: 68-89. [5] Mittal SK. Aggarwal N, Sailaja G, van Olphen A, et al. Immunization with DNA, adenovirus or both in biodegradable alginate microspheres: effect of route of inoculation on immune response[J]. Vaccine, 2001, 19: 253-263.
同類課題研究水平概述
- 在我國(guó)，中華鱉的人工養(yǎng)殖只有幾十年的歷史，盡管發(fā)展迅速，但對(duì)于中華鱉的研究不夠完善，主要集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生態(tài)分布、生長(zhǎng)繁殖、養(yǎng)殖管理等方面。雖然在中華鱉疾病防治的研究上取得了一定的進(jìn)展, 但在免疫防護(hù)、病害的預(yù)測(cè)和預(yù)報(bào)以及健康養(yǎng)殖模式上還有待于進(jìn)一步深入研究。尤其在最近幾年，促進(jìn)中華鱉健康及疾病的預(yù)防已成為增加養(yǎng)殖效率的焦點(diǎn)問題，而免疫接種法防治鱉病是最積極有效的方法之一。目前，許多國(guó)家已經(jīng)制備出了基因工程疫苗，并在實(shí)際中應(yīng)用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，歐、美、日本等已成功地將弧菌、產(chǎn)氣單胞菌、愛德華氏菌等魚類病原菌制備成全細(xì)胞滅活疫苗，并且用從菌體中提取的脂多糖、胞外蛋白等有效抗原，制備出的單克隆抗體等生物工程疫苗并已商業(yè)化生產(chǎn)。中華鱉氣單胞菌疫苗研究也已有不少報(bào)道,但由于免疫效果差或使用不方便等原因,這些疫苗的推廣應(yīng)用受到限制。為此,本實(shí)驗(yàn)將采用可生物降解的高分子聚合物為載體,研制口服緩釋微球疫苗。 國(guó)外是在50年代開始研制口服緩釋、控釋制劑,70年代被醫(yī)學(xué)界認(rèn)可上市的藥物品種逐漸增多。國(guó)外上市的口服緩釋制劑藥物品種已有200余種,不同規(guī)格的商品計(jì)有400種以上。而在國(guó)內(nèi)，口服藥物緩釋技術(shù)的研制尚屬起步階段，僅孫紅祥等采用生物降解性高分子聚合物為載體，研制了口服緩釋微球滅活疫苗，并作了相關(guān)報(bào)道。
