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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 美洲商陸果實(shí)多糖的確證和含量測(cè)定
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 目的：提取商陸果實(shí)多糖并確證其中含多糖。方法：采用超聲輔助法提取商陸果實(shí)中的多糖，提取液用多糖確證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以葡萄糖為對(duì)照，采用分光光度法在610 nm處測(cè)定其中的多糖。結(jié)果：回歸方程為：A = 20.894 C + 0.1677, R = 0.9962。結(jié)論 商陸果實(shí)中含有多糖，多糖含量為67.8mg/g。
- 詳細(xì)介紹：
- 美洲商陸（Phytolacca americana Linn.）是商陸科（Phytolaccaceae）商陸屬的多年生草本植物，又名垂序商陸、美國(guó)商陸。美洲商陸地上高度約為1米～2米，根系肥大，呈倒圓錐形。夏秋季開(kāi)花。果序下垂，漿果為扁球形，多汁液，熟時(shí)紫黑色；種子平滑。全株有毒，根及果實(shí)毒性最強(qiáng)。美洲商陸是一種入侵植物，原產(chǎn)北美洲，我國(guó)以下省份已有分布：河北、北京、天津、陜西、山西、山東、江蘇、安徽、浙江、上海、江西、福建、臺(tái)灣、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、重慶、云南、貴州、海南。傳統(tǒng)入藥部位為根，功能：止咳，利尿，消腫。 目前國(guó)內(nèi)外有研究表明，美洲商陸核糖體失活蛋白具有抗病毒的作用，用于動(dòng)植物體的抗病毒作用，對(duì)多種動(dòng)植物病毒具有廣譜抗性。且這種抗病毒蛋白通過(guò)抑制人體免疫缺損病毒(即艾滋病病毒)的復(fù)制，可達(dá)到治療艾滋病的目的，美國(guó)和南非已經(jīng)用商陸抗病毒蛋白為原料制成了治療艾滋病新藥，其療效比目前使用的藥物高100～1000倍。由此可見(jiàn)，商陸應(yīng)用前景廣闊，可開(kāi)發(fā)利用潛力巨大。植物多糖具有多種生物活性，植物多糖也具顯著的抗病毒作用，商陸果實(shí)中多糖的研究也沒(méi)見(jiàn)報(bào)道，我們擬對(duì)其果實(shí)中多糖的進(jìn)行提取和含量測(cè)定，研究結(jié)果對(duì)有著豐富資源和多種藥用活性的商陸開(kāi)發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 1 儀器與材料 瑞士BUCHI R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)eppendorf Research移液器，上海尤尼柯UV-2102C型紫外分光光度計(jì)，昆山KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器，上海亞榮SHZ-Ⅱ循環(huán)水真空泵。北京賽多利斯BT124S電子天平。 硫酸、正丁醇、氯仿、蒽酮、乙醇等為分析純，水為蒸餾水。 商陸果實(shí)2010年9月采集于學(xué)校實(shí)驗(yàn)田邊。 2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 樣品處理和提取液制備：自然干燥的商陸果實(shí)粉末過(guò)60目篩，置于干燥器中備用。精確稱取上述商陸果實(shí)粉末20.00g，置500mL錐形瓶中，加400mL蒸餾水，超聲間歇提取2次，每次20min，超聲功率100%，合并提取液，減壓蒸至約50mL，用sevege法除蛋白，反復(fù)4次，用無(wú)水乙醚除色素，反復(fù)3次，用乙醇醇沉多糖，4℃冰箱靜置過(guò)夜，4000r/min離心，沉淀定容于250mL容量瓶，即供試樣品，待用。 2.2 多糖的確證性實(shí)驗(yàn)：取2.1項(xiàng)制備的備用液，分別進(jìn)行以下多糖確證性實(shí)驗(yàn)。 2.2.1 碘試驗(yàn)：加碘試液1滴，觀察顏色變化。 2.2.2 多糖水解：加入稀鹽酸5滴，置沸水浴中加熱5－6分鐘，然后用10％氫氧化鈉液中和至中性，再加新配制的堿性酒石酸銅試液4滴，另取檢液1mL，不加酸水解直接加入上述試液4滴，兩管同置水浴上煮沸5－6分鐘。比較水解后和未經(jīng)水解生成棕紅色沉淀物的量。 2.2.3 α-萘酚試驗(yàn)：加5％萘酚試液數(shù)滴振搖后，沿管壁滴入5－6滴濃硫酸，使成兩液層，待2－3分鐘后，觀察兩層液面出現(xiàn)的顏色。 2.3 多糖的含量分析：采用蒽酮—硫酸法，以葡萄糖為對(duì)照品，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度[11-12]。 2.4 對(duì)照品溶液的制備：精確稱取50.00mg葡萄糖對(duì)照品，用蒸餾水溶解后，定容于50mL容量瓶中，即得葡萄糖對(duì)照品液(1 mg／mL)。 2.5 最大吸收波長(zhǎng)的確定： 取2.4制備的對(duì)照品溶液和2.1制備的供試樣品溶液，按2.3項(xiàng)方法，在400～700 nm處進(jìn)行掃描。 2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取2.4制備的對(duì)照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置干燥試管中，按2.3項(xiàng)方法在2.5項(xiàng)選定的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每個(gè)濃度平行測(cè)定3 次，以A值3次的平均值縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸得回歸方程。 2.7 精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液1.0 mL，共5份，按2.3項(xiàng)法操作，測(cè)定吸光值，計(jì)算RSD。 2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密吸取2.4中制備的對(duì)照品溶液1.0 mL和2.1中制備的樣品溶液0.5mL，按2.3法操作，在50min內(nèi)，每隔10 min測(cè)定吸光值，計(jì)算RSD。 2.9 加樣回收實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確取2.1中制備的樣品液 0.5mL各6份，分別加入0.4mL對(duì)照品葡萄糖溶液，按2.3法測(cè)定多糖含量，計(jì)算RSD。 2.10 商陸果實(shí)多糖含量測(cè)定： 取2.1制備的供試樣品溶液0.5mL，按2.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3 次，以A值3次的平均值代入回歸方程計(jì)算商陸果實(shí)多糖的含量。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 多糖的確證性實(shí)驗(yàn) 3.1.1 碘試驗(yàn)：提取的商陸果實(shí)多糖溶液加碘試液沒(méi)有變藍(lán)。 3.1.2 多糖水解：提取的商陸果實(shí)多糖溶液經(jīng)水解后，加入加新配制的堿性酒石酸銅試液，有棕紅色沉淀物。未水解的商陸果實(shí)多糖溶液，加入加新配制的堿性酒石酸銅試液沒(méi)有棕紅色沉淀。 3.1.3 α-萘酚試驗(yàn)：提取的商陸果實(shí)多糖溶液加5％萘酚試液和濃硫酸后，兩液層面之間有紫紅色環(huán)生成。 3.2 最大吸收波長(zhǎng)： 對(duì)照溶液的最大吸收波長(zhǎng)在610nm，供試樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)在610nm，較大吸收波長(zhǎng)在610nm，所以選定610nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。 3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線：經(jīng)線性回歸得回歸方程為：A = 28.894C + 0.1677，R = 0.9962 。 圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.1 The standard curve of the Glucose standard samples 3.4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見(jiàn)表1 表1 硫酸-蒽酮法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Table 1 The precision test by sulphuric acid-anthrone 序號(hào) 1 2 3 4 5 6 RSD 吸光度(葡萄糖) 2.193 2.184 2.227 2.214 2.167 2.173 1.07% 3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見(jiàn)表2。 表2 硫酸-蒽酮法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Table2 The stability test by sulphuric acid-anthrone 時(shí)間 min 0 10 20 30 40 50 RSD 吸光度(葡萄糖) 3.134 3.132 3.129 3.124 3.124 3.124 0.144% 吸光度(樣品) 0.666 0.660 0.658 0.657 0.658 0.657 0.523% 3.6 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見(jiàn)表3。 表3 硫酸-蒽酮法加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Table 3 The recovery test by sulphuric acid-anthrone 樣品 Sample 多糖含量mg Conlent 加標(biāo)量mg Added 加標(biāo)后總糖含量mg Found 回收率% Recovery 平均回收率% Average recovery RSD 商陸果實(shí) 3.7 商陸果實(shí)多糖含量：經(jīng)帶入回歸方程計(jì)算，商陸果實(shí)多糖含量為67.8mg / g。 4 結(jié)論與討論 4.1 在確證性實(shí)驗(yàn)中，提取液與碘試液的顏色反應(yīng)顯示商陸果實(shí)中不含淀粉類；多糖水解前后的沉淀反應(yīng)說(shuō)明商陸果實(shí)多糖提取液中不含還原糖；α-萘酚試驗(yàn)生成的紫色環(huán)預(yù)試提取液中可能有多糖。確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，商陸果實(shí)中含有多糖類成分。目前商陸果實(shí)中多糖成分研究未見(jiàn)報(bào)道，我們提取商陸果實(shí)中的多糖類化合物，并經(jīng)多糖的確證性實(shí)驗(yàn)證實(shí)商陸果實(shí)中含有多糖，用蒽酮-硫酸法測(cè)得商陸果實(shí)多糖的含量為 67.8mg / g 。 4.2 藥用植物活性成分的提取方法很多，經(jīng)典的有浸漬法、滲轆法、煎煮法、回流提取法、連續(xù)提取法等，現(xiàn)代提取方法有超聲提取、酶解提取、超臨界流體萃取、加壓液體萃取、微波輔助提取等。現(xiàn)代提取技術(shù)一般具有用時(shí)短、效率高等優(yōu)點(diǎn)。目前植物多糖的提取主要采用以下方法：溶劑提取、微波輔助提取、超聲波和酶法提取。溶劑提取法的原理是相似相溶準(zhǔn)則。多糖屬極性較強(qiáng)物質(zhì)，溶于熱水。因此采用水煎煮法能夠直接提取植物多糖。水提取植物多糖操作簡(jiǎn)便、成本低廉，至今仍在科研、生產(chǎn)領(lǐng)域中廣泛使用；微波提取則是利用微波場(chǎng)中介質(zhì)的偶極子轉(zhuǎn)向極化和界面極化的時(shí)間與微波頻率相吻合的特點(diǎn)，促使介質(zhì)滾動(dòng)能級(jí)躍遷，加劇熱活動(dòng)，將電能轉(zhuǎn)化為熱能，從而使細(xì)胞壁粉碎或溶解，達(dá)到加強(qiáng)提取效率的目的；超聲波提取植物多糖是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超聲波發(fā)生的機(jī)械振動(dòng)、乳化、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速多糖成分的擴(kuò)散開(kāi)釋并充分與溶劑混合，利于提取。我們用水為提取劑，采用超聲波提取商陸果實(shí)多糖成分。
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作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 美洲商陸（Phytolacca americana Linn.）是商陸科商陸屬的多年生藥用草本植物，入《中國(guó)藥典》。美洲商陸果實(shí)中多糖的研究尚沒(méi)見(jiàn)報(bào)道，植物多糖具有多種生物活性，我們擬提取其果實(shí)中的多糖、并經(jīng)確證性實(shí)驗(yàn)，最后進(jìn)行含量測(cè)定。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 美洲商陸是一種入侵植物，原產(chǎn)北美洲，我國(guó)貴州等20多個(gè)省份已有分布，資源極為豐富。多糖具有多種生理活性，美洲商陸果實(shí)多糖未見(jiàn)報(bào)道，我們對(duì)其果實(shí)多糖的確證研究為含量測(cè)定方法的確定提供理論依據(jù)，其含量測(cè)定的結(jié)果又為美洲商陸果實(shí)多糖開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。現(xiàn)在植物多糖在動(dòng)物養(yǎng)殖中作為綠色添加劑是該行業(yè)的新興研究熱點(diǎn)，隨著深入研究，美洲商陸果實(shí)中多糖有望成為動(dòng)物飼料添加劑行業(yè)中的新成員，服務(wù)社會(huì)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)美洲商陸核糖體失活蛋白又較深入的研究，利用用商陸抗病毒蛋白為原料已制成了治療艾滋病新藥。美洲商陸中多糖、黃酮、皂苷等成分的研究也有報(bào)道。但美洲商陸果實(shí)中多糖的研究未見(jiàn)報(bào)道，植物多糖具有多種生物活性。我們的研究成果對(duì)有著豐富資源和多種藥用活性的商陸開(kāi)發(fā)具有重要的意義。隨著深入研究，美洲商陸果實(shí)中多糖有望成為動(dòng)物飼料添加劑行業(yè)中的新成員，服務(wù)社會(huì)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 美洲商陸（Phytolacca americana Linn.）是商陸科（Phytolaccaceae）商陸屬的多年生藥用草本植物，入《中國(guó)藥典》，又名垂序商陸、美國(guó)商陸。美洲商陸地上高度約為1米～2米，根系肥大，呈倒圓錐形。夏秋季開(kāi)花。果序下垂，漿果為扁球形，多汁液，熟時(shí)紫黑色；種子平滑。全株有毒。目前國(guó)內(nèi)外有研究表明，美洲商陸核糖體失活蛋白具有抗病毒的作用，且這種抗病毒蛋白通過(guò)抑制人體艾滋病病毒的復(fù)制，可達(dá)到治療艾滋病的目的，美國(guó)和南非已經(jīng)用商陸抗病毒蛋白為原料制成了治療艾滋病新藥，其療效比目前使用的藥物高100～1000倍。美洲商陸中多糖、黃酮、皂苷等成分的研究也有報(bào)道，作為富集重金屬錳的植物，美洲商陸也是植物修復(fù)技術(shù)中的重要植物。由此可見(jiàn)，美洲商陸應(yīng)用前景廣闊，可開(kāi)發(fā)利用潛力巨大。但是美洲商陸果實(shí)中多糖的研究未見(jiàn)報(bào)道，植物多糖具有多種生物活性，也具顯著的抗病毒作用，我們對(duì)其果實(shí)中多糖的進(jìn)行提取、確證和含量測(cè)定，經(jīng)多糖確證性實(shí)驗(yàn)確證其中含多糖。商陸果實(shí)中含有多糖，多糖含量為67.8mg/g。我們的研究成果對(duì)有著豐富資源和多種藥用活性的商陸開(kāi)發(fā)具有重要的意義。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- 1] 肖培根.新編中藥志(第一卷) [M ].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2001, 926. [2] 中國(guó)藥典.2005版一部[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社. [3] 楊宇, 王錫鋒, 吳元華.美洲商陸抗病毒蛋白及其在植物病害防治中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊, 2006,26(6):23–25. [4] 趙玉, 王錫鋒, 周廣和, 等.2 個(gè)不同缺失型美洲商陸抗病毒蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)[ J] . 植物病理學(xué)報(bào), 2005, 35( 3) : 270–271. [5] 馬蕭, 祝水金, 丁偉, 等. 美洲商陸粗提物對(duì)煙草花葉病毒的控制作用[ J] .西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 18( 2) : 168–171. [6] 林愛(ài)玉,王秋穎.美州商陸抗病毒蛋白及其在艾滋病治療中的作用[J].中草藥,2003,9:附3-附6． [7] 豐貴鵬.多糖結(jié)構(gòu)的研究方法及其活性的研究進(jìn)展[J] .平原大學(xué)學(xué)報(bào),2006,23 (5):128-130. [8 ] 韓果萍 ,段玉峰.我國(guó)天然活性多糖藥理研究進(jìn)展[J ] .中藥材, 2003 , (2) :139–141. [9] 王長(zhǎng)云, 管華詩(shī). 多糖抗病毒作用研究進(jìn)展[J] . 生物工程進(jìn)展,2000 ,20(1) :17–20 . [10] 田英, 董俊興. 天然產(chǎn)物中抗艾滋病病毒活性成分的研究進(jìn)展[J] . 中國(guó)中藥雜志,2002,23[11] 黃瑞松. 中草藥多糖含量測(cè)定方法概述[J].中國(guó)藥師,2005, 8(1): 68 – 70. [12] 劉曉涵, 陳永剛, 林 勵(lì),等.蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測(cè)定枸杞子中多糖含量的比較[J].食 品 科 技, 2009, 34 (9) :270-272. [13] 蔡凌云,黎云祥,陳蕉等.白簕多糖的提取工藝和含量比較[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2009,26(2):251-257.
同類課題研究水平概述
- 植物多糖以其廣泛而強(qiáng)大的生理活性成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，有學(xué)者預(yù)言：“二十一世紀(jì)將是多糖時(shí)代”。 藥用植物活性成分的提取方法很多，經(jīng)典的有浸漬法、滲轆法、煎煮法、回流提取法等，現(xiàn)代提取方法有超聲提取、超臨界流體萃取、加壓液體萃取、微波輔助提取等。目前植物多糖的提取主要采用以下方法：溶劑提取、微波輔助提取、超聲波和酶法提取。多糖屬極性較強(qiáng)物質(zhì)，溶于熱水。因此采用水煎煮法能夠直接提取植物多糖。水提取植物多糖操作簡(jiǎn)便、成本低廉。超聲波提取植物多糖是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超聲波發(fā)生的機(jī)械振動(dòng)、乳化、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速多糖成分的擴(kuò)散開(kāi)釋并充分與溶劑混合，利于提取。我們用水為提取劑，采用超聲波提取商陸果實(shí)多糖成分。多糖的測(cè)定方法很多，目前還沒(méi)有國(guó)家規(guī)定的方法，其中一類測(cè)定方法，也是現(xiàn)在普遍使用的方法，即利用多糖在強(qiáng)酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，然后再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質(zhì)這一性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，如蒽酮-硫酸法。我們采用葡萄糖為對(duì)照品，采用蒽酮-硫酸法在610nm處測(cè)定美洲商陸果實(shí)中多糖的含量。目前多糖含量測(cè)定中作標(biāo)準(zhǔn)曲線大部分都是用葡萄糖來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)品，而不是用葡聚糖（MW500，000），因?yàn)槠暇厶菢?biāo)準(zhǔn)品國(guó)內(nèi)難求且價(jià)格昂貴。但是植物活性的水溶性多糖均由β(1—3)或β(1—6)糖苷鍵連接葡聚糖構(gòu)成主鏈和支鏈，有的甚至就是β-葡聚糖，用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定植物中的多糖含量時(shí)就會(huì)有偏差，我們以后的研究擬用葡聚糖作標(biāo)準(zhǔn)品去進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)美洲商陸的研究表明，美洲商陸核糖體失活蛋白具有抗病毒的作用，用于動(dòng)植物體的抗病毒作用，這種抗病毒蛋白通過(guò)抑制人體免疫缺損病毒(即艾滋病病毒)的復(fù)制，可達(dá)到治療艾滋病的目的，美國(guó)和南非已經(jīng)用商陸抗病毒蛋白為原料制成了治療艾滋病新藥，其療效比目前使用的藥物高100～1000倍；美洲商陸中多糖、黃酮、皂苷等成分的研究也有報(bào)道；作為富集重金屬錳的植物，美洲商陸也是植物修復(fù)技術(shù)中的重要植物。但美洲商陸果實(shí)中多糖的研究未見(jiàn)報(bào)道，植物多糖具有多種生理活性，也具有抗病毒的確切療效?，F(xiàn)在植物多糖在動(dòng)物養(yǎng)殖中作為綠色添加劑是該行業(yè)的新興研究熱點(diǎn)，我們的研究成果對(duì)有著豐富資源的入侵植物美洲商陸的開(kāi)發(fā)具有重要的意義。
