題-1_100_100.jpg)
基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 緩釋型rhBMP-2/CS生物型骨修復(fù)材料的制備及活性鑒定
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 骨移植是骨損傷缺損一種必要的治療方式，傳統(tǒng)的自體骨移植具有很多缺陷，因此急需進(jìn)行骨移植替代物的研究。BMP-2是BMP家族中骨誘導(dǎo)作用最強(qiáng)的成員，其半衰期短易降解代謝。我們利用CS與rhBMP-2復(fù)合制備緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料不僅具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，而且保持了rhBMP-2的生物活性實(shí)現(xiàn)持續(xù)緩慢釋放，能更好地滿足各種原因所致骨缺損的修復(fù)要求，臨床應(yīng)用前景十分明朗。
- 詳細(xì)介紹：
- 緩釋型rhBMP-2/CS生物型骨修復(fù)材料 的制備及活性鑒定 摘 要 背景：重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP-2）在體內(nèi)半衰期短、易降解代謝，達(dá)不到理想的骨再生效果，定位緩釋技術(shù)已成為解決這一難題的研究熱點(diǎn)。 目的：將負(fù)載rhBMP-2的殼聚糖（chitosan，CS）膜復(fù)合于材料表面制備緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，并觀察其緩釋性能、骨誘導(dǎo)活性。 方法：①rhBMP-2與CS混合制備殼聚糖膜，涂覆于生物骨修復(fù)材料表面，ELISA方法對(duì)其體外釋藥性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。②茜素紅染色檢測(cè)緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞骨鈣蛋白（Osteocalcin, OC）形成，觀察其誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的能力。③清潔級(jí)KM小鼠股部肌袋內(nèi)植入埋植物，2周后取材進(jìn)行Ca2＋離子含量測(cè)定，評(píng)價(jià)其異位骨誘導(dǎo)能力。 結(jié)果與結(jié)論：①掃描式電子顯微鏡觀察材料表面的殼聚糖膜分布均勻，負(fù)載的rhBMP-2呈團(tuán)簇狀。②rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料體外釋藥存在突釋，前4天的釋放量達(dá)總藥量的50%，持續(xù)至12天，釋藥量達(dá)到90%，第18天時(shí)釋放完全。③緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)4周后，C2C12細(xì)胞表達(dá)成骨晚期分化標(biāo)志基因OC。④術(shù)后2周，小鼠股部肌袋埋植物的Ca2＋離子含量測(cè)定緩釋型rhBMP-2/CS生物型骨修復(fù)材料的骨誘導(dǎo)活性顯著增強(qiáng)。結(jié)果提示該緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料緩釋性能好，顯著增強(qiáng)骨形成，具有臨床應(yīng)用的可行性。 關(guān)鍵詞：緩釋；rhBMP-2；殼聚糖；骨修復(fù)材料；骨形成 外傷、炎癥、腫瘤、骨骼異常和手術(shù)切除等引起的骨缺損修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題。BMP-2是骨形成與骨修復(fù)過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子[1, 2]。已有研究證實(shí)BMP-2對(duì)于成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的分化以及功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[3, 4]，無論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)均表明，BMP-2都能促進(jìn)胚干細(xì)胞[5]、間質(zhì)細(xì)胞[6]、成肌細(xì)胞[7]向成骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣蛋白、I型膠原的表達(dá)顯著上調(diào)，是BMP家族中骨誘導(dǎo)作用最強(qiáng)的成員。由于BMP-2在溶液中半衰期短，達(dá)不到理想的骨再生效果，因此怎樣在體內(nèi)獲得BMP-2的持續(xù)釋放，延長作用時(shí)間成為研究的熱點(diǎn)[8]。高分子殼聚糖（chitosan，CS）具有促進(jìn)吸收、黏膜黏附和可控制藥物釋放的功能，負(fù)載蛋白質(zhì)類藥物，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行有效的保護(hù)，避免藥物的快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，增強(qiáng)骨填充材料的組織相容性[9, 10]。本研究利用殼聚糖與重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）復(fù)合形成負(fù)載rhBMP-2的殼聚糖膜，涂覆于生物型骨修復(fù)材料表面，制備緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，并對(duì)其緩釋性能、骨誘導(dǎo)活性進(jìn)行比較、探討。 1. 材料和方法 1.1 材料：rhBMP-2凍干粉由暨南大學(xué)生物工程研究所老師提供，為大腸桿菌表達(dá)、復(fù)性、純化所得[11]；殼聚糖：脫乙酰度DD=85%，黏度200cps，購自Aldrich公司；生物型骨修復(fù)材料（由冠昊生物科技有限公司提供），為豬骨來源；rhBMP-2 ELISA檢測(cè)試劑盒（購自美國PeproTech公司）；懸臂式攪拌機(jī)（德國IKA公司）；全波長掃描多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；茜素紅等試劑（購自Sigma公司）；鼠源C2C12成肌細(xì)胞株（購自ATCC）。清潔級(jí)KM小鼠40只，由中山大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心（《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2004-0011》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2007-0081》）提供，雄性，18～22g，隨機(jī)分成4組，分別為rhBMP-2/CS復(fù)合材料組、rhBMP-2復(fù)合材料組、單純骨填充材料組。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置參照國家科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[12]。 1.2 方法： 1.2.1 rhBMP-2/CS生物型骨修復(fù)材料的制備方法按如下步驟進(jìn)行： ①CS溶于2% (v/v)的乙酸溶液，配成濃度為0.1％的溶液，將生物型多孔骨修復(fù)材料負(fù)壓下浸入上述制成的溶液中，保持2小時(shí)，取出晾干，SEM觀察CS的成膜性。②如前配制CS的乙酸溶液，然后在攪拌下，按rhBMP-2與CS的質(zhì)量比為0.01∶1的比例加入rhBMP-2，混合均勻后再如前步驟復(fù)合于材料表面后，經(jīng)環(huán)氧乙烷或輻照滅菌，包裝，即制成rhBMP-2/CS生物型骨修復(fù)材料，成品為每11mg生物型多孔骨修復(fù)材料負(fù)載有10μg rhBMP-2。 1.2.2 緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料體外釋藥實(shí)驗(yàn)研究 10個(gè)5ml離心管內(nèi)中分別盛入2ml PBS（pH7.4）和0.02%疊氮鈉（w/v），隨機(jī)分成2組，分別為rhBMP-2/CS復(fù)合材料組、對(duì)照組，rhBMP-2/CS復(fù)合材料組每個(gè)管內(nèi)加入緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料11mg，對(duì)照組每個(gè)管內(nèi)加入rhBMP-2復(fù)合材料（生物骨修復(fù)材料負(fù)壓下浸入rhBMP-2的尿素溶液中，保持0.5～2小時(shí)，取出晾干，滅菌即得，成品亦為每11mg生物骨修復(fù)材料負(fù)載有10μg rhBMP-2），搖勻，置于37℃孵箱內(nèi)，持續(xù)攪拌，記錄釋藥起始時(shí)間。分別于0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h～21天各取50μl上清（同時(shí)補(bǔ)入新鮮PBS），離心，人BMP-2 ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中rhBMP-2含量。ELISA檢測(cè)時(shí)用抗人BMP-2 capture antibody 37℃包被過夜，1%BSA封閉2.5h，加入各不同時(shí)間點(diǎn)所取上清，37℃反應(yīng)2h后加入detection antibody，室溫反應(yīng)2個(gè)小時(shí)后加入HRP稀釋液，室溫反應(yīng)30min后加入顯色液顯色，全波長掃描多功能酶標(biāo)儀讀取A405，根據(jù)繪制的人BMP-2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各不同時(shí)間點(diǎn)上清中rhBMP-2的含量。對(duì)結(jié)果進(jìn)行百分比統(tǒng)計(jì)，描繪累計(jì)釋藥曲線。 1.2.3 緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞骨鈣蛋白（OC）形成 細(xì)胞以1x104個(gè)/cm2接種于24孔板中，每孔加入500μl含10%FBS的DMEM，設(shè)單純骨填充材料對(duì)照組，分別將11mg緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料、rhBMP-2生物骨修復(fù)材料和10mMβ-甘油磷酸鈉共同誘導(dǎo)4周后，細(xì)胞用PBS洗2次，根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道方法染色，70%乙醇于-20℃固定60min，晾干，10mg/ml茜素紅作用15min，雙蒸水洗3-4次，PBS孵育20min，風(fēng)干，倒置相差顯微鏡鏡下觀察并拍照。 1.2.4 緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)小鼠異位骨形成 根據(jù)BMP-2質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[14]，小鼠股部肌袋埋植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)異位骨形成的能力，清潔級(jí)KM小鼠30只，雄性，18～22g，隨機(jī)分成3組，分別為rhBMP-2/CS復(fù)合材料組、rhBMP-2復(fù)合材料組、單純骨填充材料組。巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，暴露右側(cè)大腿股部肌肉，分別將各組材料植入到KM小鼠的后腿肌肉內(nèi)，進(jìn)行埋植實(shí)驗(yàn)，術(shù)后兩周取出埋植物進(jìn)行新生骨Ca2＋離子含量測(cè)定，評(píng)價(jià)各組材料異位骨誘導(dǎo)情況。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以xˉ±s表示，組間差異采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)、完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。 2. 結(jié)果 2.1 rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料的SEM觀察 復(fù)合前生物骨修復(fù)材料是多孔的，空隙大小不均，表面有白色顆粒狀物質(zhì)；復(fù)合的CS膜在材料表面覆蓋比較均勻；復(fù)合負(fù)載rhBMP-2的CS膜后，材料表面明顯觀察到有團(tuán)簇狀的物質(zhì)，且分布均勻，說明rhBMP-2和CS形成了均一的藥膜覆蓋于材料表面。見圖1。 2.2緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料體外藥物釋放曲線 將生物骨修復(fù)材料負(fù)壓下浸入制成的rhBMP-2/CS溶液中時(shí)， 95%±3的rhBMP-2可被吸附到生物骨修復(fù)材料上，成品為每10μg rhBMP-2復(fù)合于11mg生物骨修復(fù)材料。體外藥物釋放曲線顯示，復(fù)合的rhBMP-2至少能在12天的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放，前4天的釋放量達(dá)到總藥量的50%，然后持續(xù)至12天時(shí)，釋藥量達(dá)到90%，在第18天時(shí)藥物釋放完全。對(duì)照組為rhBMP-2復(fù)合材料組，在6h時(shí)藥物即完全釋放。 2.3緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞OC形成 OC是一個(gè)維生素K依賴、維生素D誘導(dǎo)的鈣連基質(zhì)蛋白, 它是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志[15]。取對(duì)數(shù)生長期C2C12細(xì)胞接種于24孔板中，分別將11mg緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料、rhBMP-2生物骨修復(fù)材料和10mMβ-甘油磷酸鈉共同誘導(dǎo)，設(shè)單純骨填充材料對(duì)照組，4周后進(jìn)行茜素紅染色，檢測(cè)OC表達(dá)情況，OC陽性細(xì)胞呈桔紅色染色。結(jié)果顯示，對(duì)照組幾乎沒有細(xì)胞呈陽性，rhBMP-2生物骨修復(fù)材料組可見部分細(xì)胞呈陽性染色，而經(jīng)緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞絕大多數(shù)都被染成桔紅色，由此說明rhBMP-2與CS成膜后由于緩釋作用，導(dǎo)致rhBMP-2的持續(xù)釋放，從而在較長時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞向成骨晚期分化的能力明顯增強(qiáng)。 2.4緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)小鼠異位骨形成 小鼠股部肌袋埋植實(shí)驗(yàn)中，兩周后取出埋植物進(jìn)行新生異位骨Ca2＋離子含量測(cè)定，結(jié)果顯示與單純骨填充材料組以及rhBMP-2生物骨修復(fù)材料組相比，該緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)小鼠異位骨形成的能力顯著增強(qiáng)（P﹤0.05）。 3、討論 骨移植是骨損傷與骨缺損一種必要的治療方式，是臨床上僅次于輸血的、應(yīng)用最多的異體移植技術(shù)。在骨移植手術(shù)中，傳統(tǒng)的自體骨移植雖然理想，但是具有很多缺陷，如供骨區(qū)損傷、手術(shù)出血量大、植骨量不足、不能制備特殊形狀、由于延遲愈合甚至不愈合所引起的二次手術(shù)比率高等等，因此急需進(jìn)行骨移植替代物的研究。國外已有大量臨床研究表明[16,17]，rhBMP2能顯著提高骨折、腰椎間盤退變性疾病等患者手術(shù)中的骨融合比率以及一次性手術(shù)成功率，無論是與自體骨移植物聯(lián)用，還是與假體替代物聯(lián)用，均具有非常明顯的治療優(yōu)勢(shì)，能顯著促進(jìn)創(chuàng)口愈合、減少二次手術(shù)比率、減少術(shù)中出血量、降低整體手術(shù)傷害，并能降低患者創(chuàng)口感染率，減少患者的手術(shù)痛苦，臨床應(yīng)用前景十分明朗。 由于骨缺損的修復(fù)是一個(gè)相對(duì)緩慢的過程，而rhBMP2在水相及室溫環(huán)境下易于失去生物活性，在體內(nèi)還存在酶解作用，直接使用會(huì)很快失活，達(dá)不到理想的骨再生效果，怎樣實(shí)現(xiàn)rhBMP2的定位緩釋成為研究的熱點(diǎn)[18,19]。因此，我們利用高分子殼聚糖對(duì)生物骨修復(fù)材料表面進(jìn)行改性，形成負(fù)載有治療有效量的rhBMP-2的殼聚糖膜復(fù)合到材料表面，制備緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，SEM觀察形成的殼聚糖膜覆蓋面積大，分布均勻。體外釋藥檢測(cè)曲線存在突釋期，前4天的釋藥量達(dá)到50%，分析原因可能為早期釋放時(shí)覆蓋于材料表面的殼聚糖膜表面積較大，釋放量大所形成的，后期釋放時(shí)由于主要從材料孔隙釋藥，速度變慢，從而顯示至少能在12天內(nèi)實(shí)現(xiàn)rhBMP-2的緩慢持續(xù)釋放，至12天時(shí)釋藥量達(dá)到90%。 體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明此緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料具有較強(qiáng)的骨再生活性，體外誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，表達(dá)成骨晚期指標(biāo)---骨鈣蛋白，與對(duì)照組、rhBMP-2直接復(fù)合組相比，緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞向成骨晚期分化的能力顯著增強(qiáng)，說明rhBMP-2與CS成膜后的緩慢持續(xù)釋放保證了較長時(shí)間內(nèi)rhBMP-2的骨誘導(dǎo)活性，除此之外，也間接說明了此CS膜對(duì)rhBMP-2具有一定的保護(hù)作用，避免其由于降解而失活，具體原因有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與單純骨填充材料、非緩釋型rhBMP-2復(fù)合材料比較，能明顯促進(jìn)小鼠肌袋異位骨的形成。因此，我們制備的緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，不僅具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，而且可以保持rhBMP-2的生物活性，并實(shí)現(xiàn)rhBMP-2的持續(xù)緩慢釋放，能更好地滿足創(chuàng)傷、感染、腫瘤及發(fā)育異常等原因所致骨缺損的修復(fù)要求。 另外，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)CS與rhBMP-2混合后能在材料表面形成均勻的藥膜并且緩釋性能較好，考慮到目前使用的材料為異種骨來源，雖經(jīng)過處理，但仍具有一定的免疫原性，臨床應(yīng)用受限，因此我們下一步準(zhǔn)備單獨(dú)將CS與rhBMP-2混合比例進(jìn)行優(yōu)化、凍干后制備殼聚糖藥膜，并對(duì)其理化性能作進(jìn)一步研究（溶脹性、對(duì)rhBMP-2的保護(hù)等），以期為rhBMP-2/CS膜在臨床的應(yīng)用提供理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。 4、參考文獻(xiàn) [1] Urist MR. Bone: formation by autoinduction. Science. 1965;150:893-899. [2] Takahashi Y, Yamamoto M, Tabata Y. Enhanced osteoinduction by controlled release of bone morphogenetic protein-2 from biodegradable sponge composed of gelatin and beta-tricalcium phosphate. Biomaterials. 2005;26(23):4856-4865. [3] Cowan CM, Aalami OO, Shi YY, et al. Bone morphogenetic protein 2 and retinoic acid accelerate in vivo bone formation, osteoclast recruitment, and bone turnover. Tissue Eng. 2005;11(3-4):645-658. [4] Zuscik MJ, Ma L, Buckley T, et al. Lead induces chondrogenesis and alters transforming growth factor-beta and bone morphogenetic protein signaling in mesenchymal cell populations. Environ Health Perspect. 2007;115(9):1276-1282. [5] Yamashita A, Takada T, Narita J, et al. Osteoblastic differentiation of monkey embryonic stem cells in vitro. Cloning Stem Cells. 2005;7(4):232-237. [6] Meinel L, Hofmann S, Betz O, et al. Osteogenesis by human mesenchymal stem cells cultured on silk biomaterials: comparison of adenovirus mediated gene transfer and protein delivery of BMP-2. Biomaterials. 2006;27(28):4993-5002. [7] Zhao B, Katagiri T, Toyoda H, et al. Heparin potentiates the in vivo ectopic bone formation induced by bone morphogenetic protein-2. J Biol Chem. 2006;281(32):23246-23253. [8] Oju J, Su JS, Sun WK, et al. Enhancement of ectopic bone formation by bone morphogenetic protein-2 released from a heparin-conjugated poly (L-lactic-co-glycolic acid) scaffold. Biomaterials. 2007;28:2763-2771. [9] Lai WF, Marie CM L. Nucleic acid delivery with chitosan and its derivatives. J Control Release. 2009;134(3):158-168. [10] Ander A, Ana C, Viviana R, et al. Chitosan Film as rhBMP2 Carrier: Delivery Properties for Bone Tissue Application. Biomacromolecules. 2008;9(2):711-718. [11] 一種重組人骨形成蛋白-2的表達(dá)方法. 專利號(hào): ZL 2006 0032800.7 [12] 中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部. 關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見. 2006-09-30. [13] Chaudhary LR, Hofmeister AM, Hruska KA. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 2004;34(3):402-411. [14] 王軍志. 生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制(第二版)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2007:794-799. [15] Stein GS, Lian JB, Owen TA. Bone cell differentiation: a functionally coupled relationship between expression of cell-growth and tissue-specific genes. Curr-Op in-Cell-Biol. 1990;2(6) 1018-1227. [16] Garrison KR, Shemilt I, Donell S, et al. Bone morphogenetic protein (BMP) for fracture healing in adults. Cochrane Database Syst Rev. 2010;16(6):CD006950. [17] Axelrad TW, Einhorn TA. Bone morphogenetic proteins in orthopaedic surgery. Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20(5-6):481-488. [18] McKay WF, Peckham SM, Badura JM. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). Int Orthop. 2007;31(6):729-734. [19] Mieszawska AJ, Kaplan DL. Smart biomaterials - regulating cell behavior through signaling molecules. BMC Biol. 2010;19(8):57-59
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 由外傷、炎癥、手術(shù)切除等引起的骨缺損修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界面臨難題。已有研究證實(shí)BMP-2是BMP家族中骨誘導(dǎo)作用最強(qiáng)的成員，但是 BMP-2在溶液中半衰期短。高分子殼聚糖（CS）具有促進(jìn)吸收和可控制藥物釋放的功能。因此，我們利用CS與rhBMP-2復(fù)合形成負(fù)載rhBMP-2的殼聚糖膜涂覆于生物型骨修復(fù)材料表面，制備緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，并對(duì)其緩釋性能、骨誘導(dǎo)活性進(jìn)行檢測(cè)
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- hBMP2與殼聚糖類大分子復(fù)合形成緩釋型殼聚糖藥膜，并以骨填充材料為支撐物制備緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，實(shí)現(xiàn)了rhBMP2的定點(diǎn)緩釋，為解決rhBMP2的臨床應(yīng)用難題提供了基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 傳統(tǒng)的自體骨移植雖然理想，但是具有很多缺陷，因此急需進(jìn)行骨移植替代物的研究。我們制備的緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，不僅具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，而且可以保持rhBMP-2的生物活性，并實(shí)現(xiàn)rhBMP-2的持續(xù)緩慢釋放，能更好地滿足創(chuàng)傷、感染、腫瘤及發(fā)育異常等原因所致骨缺損的修復(fù)要求，臨床應(yīng)用前景十分明朗。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 背景：重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2在體內(nèi)半衰期短易降解代謝，達(dá)不到理想的骨再生效果，定位緩釋技術(shù)已成為解決這一難題的研究熱點(diǎn)。 目的：將負(fù)載rhBMP-2的殼聚糖（chitosan，CS）膜復(fù)合于材料表面制備緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，并觀察其緩釋性能、骨誘導(dǎo)活性。 方法：①制備緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，用ELISA方法對(duì)其體外釋藥性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。②茜素紅染色檢測(cè)其誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞骨鈣蛋白（OC）形成，觀察其誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的能力。③清潔級(jí)KM小鼠股部肌袋內(nèi)植入埋植物，2周后進(jìn)行Ca2＋離子含量測(cè)定，評(píng)價(jià)其異位骨誘導(dǎo)能力。 結(jié)果：①掃描式電子顯微鏡觀察，負(fù)載的rhBMP-2呈團(tuán)簇狀。②它體外釋藥存在突釋，第18天時(shí)釋放完全。③誘導(dǎo)4周后，C2C12細(xì)胞表達(dá)成骨晚期分化標(biāo)志基因OC。④術(shù)后2周， Ca2＋離子含量測(cè)定表明其骨誘導(dǎo)活性顯著增強(qiáng)。結(jié)果提示料緩釋性能好，顯著增強(qiáng)骨形成，具有臨床應(yīng)用的可行性。
獲獎(jiǎng)情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- 1. Urist MR. Bone: formation by autoinduction. Science. 1965;150:893-899 2.Takahashi Y, Yamamoto M, Tabata Y. Enhanced osteoinduction by controlled release of bone morphogenetic protein-2 from biodegradable sponge composed of gelatin and beta-tricalcium phosphate. Biomaterials. 2005;26(23):4856-4865.
同類課題研究水平概述
- 臨床上由于各種創(chuàng)傷與疾病造成的骨損傷與骨缺損極為常見，骨移植對(duì)于提供支持、填充骨腔、加速骨缺損愈合是一種必要的治療方式，傳統(tǒng)的自體骨移植仍是目前最理想的骨移植材料，是骨移植的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是具有很多缺陷，如供骨區(qū)損傷、手術(shù)出血量大、二次手術(shù)比率高等等，因此促進(jìn)了骨移植替代材料的研究。隨著科學(xué)技術(shù)進(jìn)步和生產(chǎn)力的迅速發(fā)展，人們生活水平得以提高，如何改善臨床治療和修復(fù)水平以增進(jìn)患者的健康和生命質(zhì)量正日益受到政府和社會(huì)的廣泛關(guān)注和重視，其研究焦點(diǎn)之一集中在對(duì)新型生物醫(yī)用材料的探索上。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白屬于轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-β家族的一員，具有獨(dú)特的誘導(dǎo)成骨能力，在體內(nèi)誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞分化形成軟骨和新生骨，在體外則能誘導(dǎo)骨髓腔內(nèi)骨髓源性干細(xì)胞，關(guān)節(jié)腔內(nèi)的脂肪組織、髕韌帶組織和滑膜組織的細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。其中誘骨活性較強(qiáng)的成員為BMP2、BMP7，可使斷骨快速再接和缺骨快速再生，在骨科、口腔科和矯形外科具有廣泛的應(yīng)用前景，是目前組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最受人矚目的細(xì)胞因子。 大量研究表明，BMP能在原來的成骨部位誘導(dǎo)骨的形成，并與自體骨融合，誘導(dǎo)形成的新骨具有良好的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度，提示能有效的應(yīng)用于臨床治療，美國FDA也于2002年7月批準(zhǔn)重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2用于脊柱融合。國外已有臨床研究研究報(bào)告[16,17]，rhBMP2能顯著提高骨折、腰椎間盤退變性疾病等患者手術(shù)中的骨融合比率以及一次性手術(shù)成功率，無論是與自體骨移植物聯(lián)用，還是與假體替代物聯(lián)用，均具有非常明顯的治療優(yōu)勢(shì)，能顯著促進(jìn)創(chuàng)口愈合、減少二次手術(shù)比率、減少術(shù)中出血量、降低整體手術(shù)傷害，并能降低患者創(chuàng)口感染率，減少患者的手術(shù)痛苦，應(yīng)用于一般性的骨折治療，可使療程縮短一半以上，臨床應(yīng)用前景十分明朗。 由于骨缺損的修復(fù)是一個(gè)相對(duì)緩慢的過程，而rhBMP2在水相及室溫環(huán)境下易于失去生物活性，在體內(nèi)還存在酶解作用，直接使用會(huì)很快失活，達(dá)不到理想的骨再生效果，怎樣實(shí)現(xiàn)rhBMP2的定位緩釋成為研究的熱點(diǎn)[18,19]。因此，我們利用高分子殼聚糖對(duì)生物骨修復(fù)材料表面進(jìn)行改性，形成負(fù)載治療有效量的rhBMP-2的殼聚糖藥膜復(fù)合到材料表面，制備緩釋型rhBMP-2/CS生物骨修復(fù)材料，SEM觀察形成的殼聚糖膜的物理性能，檢測(cè)體外釋藥曲線，骨鈣素形成檢測(cè)，體內(nèi)異位骨形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其誘導(dǎo)骨形成的生物活性。
