題-1_100_100.jpg)
基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 微生物毒素AFB1誘導(dǎo)小鼠肝臟病變過程中相關(guān)蛋白功能研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 黃曲霉毒素(Aflatoxins)是黃曲霉(A．flavors)和寄生曲霉(A．parasiticus)等產(chǎn)毒菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,其中黃曲霉毒素B1是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的毒性和致癌性最強(qiáng)的天然污染物。
- 詳細(xì)介紹：
- 黃曲霉毒素(Aflatoxins)是黃曲霉(A．flavors)和寄生曲霉(A．parasiticus)等產(chǎn)毒菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,其中黃曲霉毒素B1是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的毒性和致癌性最強(qiáng)的天然污染物。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等多種實(shí)驗(yàn)手段結(jié)合起來研究黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)表達(dá)的肝臟蛋白的功能。研究用黃曲霉毒素B1，處理小白鼠和細(xì)胞， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFB1不僅會造成小白鼠發(fā)病 ，也會造成細(xì)胞不同程度上的損傷。運(yùn)用雙向電泳找出小鼠發(fā)病后肝臟的差異蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜分析得到蛋白的氨基酸序列，用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測其結(jié)構(gòu)及功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30個蛋白質(zhì)點(diǎn)變化差異顯著。分析其中7個明顯上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn),其中有4個蛋白可能屬于引發(fā)小鼠肝臟發(fā)生病變或癌變的蛋白質(zhì)點(diǎn)，另外3個蛋白可能參與小鼠肝臟能量與物質(zhì)的代謝。結(jié)果表明，這些蛋白對小鼠肝臟都有著很大的影響 。 選取其中與腫瘤關(guān)系較大基因atp5b進(jìn)行研究，利用熒光定量PCR技術(shù)分析atp5b在免疫小鼠肝臟中的動態(tài)變化情況，結(jié)果與雙向電泳的結(jié)果基本一致。為了進(jìn)一步研究atp5b的細(xì)胞生物學(xué)功能，本研究構(gòu)建過表達(dá)載體pCDNA3.1(-)-atp5b、RNA干擾載體pGPU6/GFP/neo-shRNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中，G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。研究發(fā)現(xiàn)，AFB1處理會引起細(xì)胞中atp5b含量的降低；而在atp5b過表達(dá)的體系中，在缺氧條件下，細(xì)胞增殖率變小，生長緩慢；在atp5b干擾的細(xì)胞系中，MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的3個shRNA片段中shRNA1、shRNA2組細(xì)胞增殖率大于1，shRNA3組細(xì)胞增殖率小于1；干擾apt5b后細(xì)胞耐受AFB1的能力降低。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了atp5b對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，也將為闡明腫瘤細(xì)胞中ATP合成酶的功能提供了理論依據(jù)。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 黃曲霉毒素，是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的毒性和致癌性最強(qiáng)的天然污染物。目前國內(nèi)外在黃曲霉毒素致毒機(jī)理方面的研究大都缺乏系統(tǒng)性，這對深入全面地了解黃曲霉毒素的毒理作用，對其誘發(fā)的腫瘤進(jìn)行標(biāo)本兼治很不利的。本研究通過比較正常和病理情況下蛋白質(zhì)在肝臟中表達(dá)差異，能夠同時發(fā)現(xiàn)與病理改變有關(guān)的一系列疾病特異性蛋白質(zhì)，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等多種實(shí)驗(yàn)手段結(jié)合起來研究黃曲霉毒素誘導(dǎo)的小鼠肝臟相關(guān)蛋白的功能。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本研究以昆明鼠作為模式動物，大大降低了試驗(yàn)成本，同時結(jié)合多種試驗(yàn)方法研究黃曲霉毒素誘導(dǎo)的小鼠肝臟蛋白的功能。將為今后生物毒素研究搭建了一個較理想的平臺 。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本研究從感染老鼠開始到定位特異蛋白在經(jīng)典發(fā)病途徑中的作用，是國內(nèi)外首次系統(tǒng)的對污染農(nóng)產(chǎn)品的黃曲霉毒素的致毒機(jī)理進(jìn)行研究。 本研究將為系統(tǒng)地揭示黃曲霉毒素誘導(dǎo)疾病的發(fā)生機(jī)制鋪平道路，為完善疾病的發(fā)生通路提供有益信息，為疾病的診斷提供新的分子標(biāo)記，同時為肝癌的治療和藥物開發(fā)提供了一些新的思路。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本研究用黃曲霉毒素B1，處理小白鼠和細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AFB1會造成小白鼠發(fā)病，同時會造成細(xì)胞不同程度上的損傷。然后運(yùn)用雙向電泳找出小鼠發(fā)病后肝臟的差異蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜分析得到蛋白的氨基酸序列，用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測其結(jié)構(gòu)及功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)30個蛋白質(zhì)點(diǎn)變化差異顯著，分析其中7個明顯上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。其中有4個蛋白可能屬于引發(fā)小鼠肝臟發(fā)生病變或癌變的蛋白質(zhì)點(diǎn)，另外3個蛋白可能參與小鼠肝臟能量與物質(zhì)的代謝。這些蛋白對小鼠肝臟都有著莫大的影響。 本研究選取其中與腫瘤關(guān)系較大基因atp5b進(jìn)行研究，先利用熒光定量PCR分析其在免疫小鼠肝臟中的動態(tài)變化情況，結(jié)果與雙向電泳的結(jié)果基本一致。然后構(gòu)建過表達(dá)載體和RNA干擾載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中，用以研究atp5b的細(xì)胞生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，AFB1處理會引起細(xì)胞中atp5b含量的降低；在atp5b過表達(dá)的體系中，缺氧條件下，細(xì)胞增殖率變小，生長緩慢；在atp5b干擾的細(xì)胞系中，MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的3個shRNA片段中shRNA1、shRNA2組細(xì)胞增殖率大于1，shRNA3組細(xì)胞增殖率小于1。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了atp5b對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，也將進(jìn)一步闡明在腫瘤細(xì)胞中ATP合成酶的功能提供了條件。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- [1] 蘇建家, 李瑗, 班克臣, 等. 動態(tài)研究HBV和AFB1誘發(fā)樹鼩肝細(xì)胞癌過程中一些基因的表達(dá)[J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 18(2): 15l-154. [2] J. Sambrook，E．F．Fritsch，T．Maniatis著．分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]．金冬雁，黎孟楓譯．第二版．北京：科學(xué)出版社，1996：19-55 [3]Okazaki S, Naganuma A, Kuge S. Peroxiredoxin-mediated redox regulation of the nuclear localization of Yap1 a transcription factor in budding yeast. Antioxid Redox Signal, 2005, 7 (324):327-333
同類課題研究水平概述
- 在天然污染的糧食中以黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，量也最多，致癌性也最強(qiáng)，它屬于肝臟毒素，能誘發(fā)肝癌。雖然AFB1的致癌機(jī)制由于缺乏直接的證據(jù)而一直不能充分肯定，但是許多相關(guān)研究表明黃曲霉毒素，特別是AFB1于肝癌的發(fā)生確實(shí)有莫大的關(guān)系。研究顯示，AFB1進(jìn)入體內(nèi)后由于具有親肝性首先在肝細(xì)胞內(nèi)聚積，隨后在細(xì)胞色素P450系統(tǒng)作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?,9-環(huán)氧AFB1 (AFB1-8,9-epoxide，AFBO)，催化這一代謝的關(guān)鍵酶為細(xì)胞色素P450，該酶正好主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)。在P450 3A4作用下的形成exo-AFBO為人類所知的具有基因毒性和致癌性的AFB1代謝產(chǎn)物。AFB1的基因毒性之一是誘發(fā)DNA損傷和導(dǎo)致基因突變。AFBO能和DNA分子共價結(jié)合形成AFB1-DNA，這一加合物的形成是其發(fā)揮基因毒性的關(guān)鍵步驟。目前關(guān)于黃曲霉毒素致癌的分子機(jī)制已經(jīng)有了一個大概的輪廓，但在其致癌過程中所涉及的具體效應(yīng)分子還不是很清楚。秦雪等人用雙向電泳等技術(shù)建立樹鼩肝癌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并對PrxⅡ蛋白的差異表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)該蛋白在肝癌組織中的蛋白表達(dá)及基因表達(dá)水平均較癌前組織明顯上調(diào)。Domenico C等在其研究中應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測到骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)高度表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞質(zhì)，其表達(dá)與這些腫瘤的病理分級存在密切聯(lián)系表明，OPN在腫瘤演進(jìn)中發(fā)揮了重要作用。肝癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多基因參與的病理過程其機(jī)制錯綜復(fù)雜，如何評價某種蛋白在該病理過程中所起的作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
