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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- c-myc、Livin基因的表達(dá)在內(nèi)毒素致肝細(xì)胞凋亡中的作用及CA的保護(hù)效應(yīng)
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 內(nèi)毒素（ET)在革蘭氏陰性細(xì)菌感染發(fā)病機(jī)理中起著十分重要的作用。尾靜脈注射ET建立大鼠內(nèi)毒素血癥模型，并觀察多價(jià)陽離子A（CA）對(duì)其的保護(hù)效應(yīng)，結(jié)果顯示ET組中各時(shí)間段的肝細(xì)胞凋亡指數(shù)一直上升，CA組的肝細(xì)胞凋亡及病理組織學(xué)改變較輕；ET可上調(diào)c-myc基因和下調(diào)Livin基因的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，CA則能明顯下調(diào)c-myc基因和上調(diào)Livin基因的表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞凋亡。
- 詳細(xì)介紹：
- 本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)研究?jī)?nèi)毒素(ET)對(duì)大鼠肝臟c-myc、Livin基因的表達(dá)變化、肝細(xì)胞凋亡情況及陽離子A(CA)的保護(hù)效應(yīng)。將72只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為3組：第Ⅰ組為NS對(duì)照組(n=24)、第Ⅱ組為ET致病組(n=24)、第Ⅲ組為ET+CA保護(hù)組(n=24），三組動(dòng)物經(jīng)相應(yīng)處理后分別在3h、4h、8h、12h采集肝臟作為樣本。 本實(shí)驗(yàn)通過大鼠注射ET后，經(jīng)PI染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果表明對(duì)照組肝細(xì)胞的凋亡率在3h、4h、8h、12h時(shí)分別為2.45％、2.71％、3.28％、3.06％；ET組肝細(xì)胞凋亡率在3h、4h、8h、12h時(shí)分別為10.98％、14.75％、19.23％、24.13％，明顯高于各同時(shí)期對(duì)照組(P<0.01)，且隨著時(shí)間的增加而增加，這提示了ET能顯著促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡。 c-myc基因作為一個(gè)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的主要基因，可激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路。本研究實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組和ET組均能檢測(cè)到熒光信號(hào)，方差分析結(jié)果表明ET組c-myc基因相對(duì)拷貝數(shù)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，在對(duì)照組和ET組均有c-myc基因的表達(dá)，t檢驗(yàn)結(jié)果表明c-myc基因ET組在肝臟表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可判斷，ET組肝臟c-myc基因的表達(dá)隨時(shí)間的增加一直呈上升趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，ET可明顯誘導(dǎo)c-myc基因表達(dá)的上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 Livin是最近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族中的新成員，是一種作用很強(qiáng)的凋亡抑制因子。 本研究實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組和ET組均能檢測(cè)到熒光信號(hào)，方差分析結(jié)果表明肝臟ET組Livin基因的相對(duì)拷貝數(shù)極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。免疫組化的研究結(jié)果顯示，在對(duì)照組和ET組均有Livin基因的表達(dá)，方差分析結(jié)果表明Livin基因在ET組肝臟表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。由此可以看出，ET組肝臟Livin基因的表達(dá)變化隨時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ET能下調(diào)Livin基因的表達(dá)，使肝細(xì)胞凋亡加劇，這是造成肝細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。 Rietschel認(rèn)為干擾ET結(jié)構(gòu)或干擾含有ET結(jié)構(gòu)的膜的藥物都可以幫助殺死細(xì)菌。David等在對(duì)內(nèi)毒素拮抗的研究中發(fā)現(xiàn)帶正電荷的藥物是通過其所帶正電荷基因與內(nèi)毒素脂質(zhì)A上的磷酸基團(tuán)結(jié)合，從而破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)及其生物活性。本實(shí)驗(yàn)以CA作為多價(jià)陽離子拮抗劑進(jìn)行內(nèi)毒素保護(hù)作用的研究，CA的保護(hù)效應(yīng)表現(xiàn)在c-myc基因和Livin基因的表達(dá)變化上。本實(shí)驗(yàn)中用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)定的結(jié)果顯示，CA保護(hù)組肝臟c-myc基因相對(duì)拷貝數(shù)在8h極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，3h、4h、12h顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；3h顯著低于ET組(P<0.05)；4h、8h、12h極顯著低于ET組(P<0.01)。CA保護(hù)組肝臟Livin基因相對(duì)拷貝數(shù)在3h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，4h、8h、12h 極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；4h顯著高于ET組(P<0.05)，3h、8h、12h極顯著高于ET組(P<0.01)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CA保護(hù)組c-myc基因表達(dá)蛋白3h、4h、8h、12h的積分光密度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，極顯著低于ET組(P<0.01)。CA保護(hù)組Livin基因表達(dá)蛋白3h、4h、8h、12h的積分光密度極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，極顯著高于ET組(P<0.01)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，CA保護(hù)組肝臟c-myc基因的表達(dá)變化呈先上升后下降的趨勢(shì)，而Livin基因的表達(dá)變化則呈先下降后上升的趨勢(shì)。如前所述，c-myc是促凋亡基因，Livin是抗凋亡基因，因此，與ET組相比，CA保護(hù)組c-myc基因表達(dá)的降低和Livin基因表達(dá)的升高，必然使肝細(xì)胞凋亡受到抑制。其原因是CA下調(diào)c-myc基因的表達(dá)和上調(diào)Livin基因的表達(dá)抑制肝細(xì)胞的凋亡。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，CA對(duì)由ET誘導(dǎo)的肝臟損傷有明顯的保護(hù)效應(yīng)，這為臨床防治內(nèi)毒素血癥和開發(fā)抗內(nèi)毒素藥物提供理論依據(jù)。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 為了探討內(nèi)毒素(ET)對(duì)肝細(xì)胞的損傷機(jī)制，本作品采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、免疫組織化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)研究ET對(duì)大鼠肝臟c-myc、Livin基因的表達(dá)變化，肝細(xì)胞凋亡情況及陽離子A(CA)的保護(hù)效應(yīng)。分別在3 h、4 h、8 h、12 h檢測(cè)各分組肝臟組織細(xì)胞凋亡情況、c-myc、Livin基因相對(duì)拷貝數(shù)及c-myc、Livin基因表達(dá)蛋白的積分光密度并觀察CA對(duì)上述指標(biāo)的影響。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 作品采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、免疫組織化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，從分子和細(xì)胞水平揭示ET導(dǎo)致c-myc、Livin基因的表達(dá)差異變化，肝細(xì)胞調(diào)亡情況及陽離子A(CA)的保護(hù)效應(yīng)，結(jié)果真實(shí)且可信度高，對(duì)于闡明ET的致病機(jī)制，防治內(nèi)毒素血癥具有積極的指導(dǎo)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 陽離子A（CA）能夠上調(diào)肝臟Livin基因的表達(dá)和下調(diào)c-myc基因的表達(dá)，從而顯著地抑制肝細(xì)胞的凋亡，對(duì)內(nèi)毒素導(dǎo)致的組織和細(xì)胞的損傷有顯著的保護(hù)效應(yīng)。在臨床上，為內(nèi)毒素(ET)引起的內(nèi)毒素血癥，在治療療效上達(dá)到療效確切、毒副作用小、價(jià)格低廉提供了一個(gè)較有前景的方向。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，免疫組織化學(xué)技術(shù)研究?jī)?nèi)毒素(ET)對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡情況、肝臟組織中c-myc、Livin基因的表達(dá)變化及陽離子A(CA)的保護(hù)效應(yīng)。將72只大鼠隨機(jī)分為三組，第Ⅰ組為NS對(duì)照組(n=24)、第Ⅱ組為ET致病組(n=24)、第Ⅲ組為ET+CA保護(hù)組(n=24)，各組經(jīng)相應(yīng)處理后分別在3 h、4 h、8 h、12 h檢測(cè)各組肝臟組織細(xì)胞凋亡情況、c-myc、Livin基因相對(duì)拷貝數(shù)及c-myc、Livin蛋白的積分光密度并觀察CA對(duì)上述指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示ET組中各時(shí)間段的肝組織中肝細(xì)胞凋亡指數(shù)一直上升，CA組的肝細(xì)胞凋亡及病理組織學(xué)改變較輕。在mRNA水平和蛋白水平上，ET組c-myc基因表達(dá)量增加但Livin基因表達(dá)量下降，而CA組的肝細(xì)胞凋亡數(shù)較ET組有所減少，c-myc基因表達(dá)量減少但Livin基因表達(dá)量上升。結(jié)論為ET可上調(diào)c-myc基因的表達(dá)和下調(diào)Livin基因的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。CA則能明顯下調(diào)c-myc基因的表達(dá)和上調(diào)Livin基因的表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞凋亡，對(duì)ET誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)效應(yīng)。
獲獎(jiǎng)情況
- 2011年4月獲得校級(jí)第九屆“挑戰(zhàn)杯”學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽一等獎(jiǎng) 2011年5月獲得第六屆云南高校青年學(xué)術(shù)科技節(jié)自然科學(xué)類二等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- [1] Kroemer G, Zamzml N, Susin SA. Mitochondrial control of apopotosis[J]. Immtmol Today, 1971, 8: 44-51 [2] Evan GL, Wylie AH. Gibert CS, et al. Induction of Apoptosis in roblasb by C-myc protein[J]. Cell. 1992, 69: 119-128 [3] 朱如瑋，康蘇婭，吳德明，等. p53、C-erbB、C-myc和p16基因蛋白產(chǎn)物在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)[J]，中華病理雜志，1997，26(6)：343-345 [4] 彭黎明，王曾禮. 細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)與臨床[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社．2000，l18 [5] Carter BZ，Milela M ，Ahieri DC，et a1．Cytokine regulated expression of survivin in myeloid leukemia．Blood，2006，97(9)：2784 [6] Kasof GM，Comes BC．Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family member [J]．Biological Chemistry, 2001, 276(5): 3238-3246 [7] Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al．Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern[J]．FEBS Lett, 2001, 495(122): 56-60 [8] 楊建發(fā)．陽離子A拮抗內(nèi)毒素生物學(xué)效應(yīng)機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究[D]．昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，2002
同類課題研究水平概述
- 盡管一個(gè)多世紀(jì)以來學(xué)者們對(duì)ET進(jìn)行了深入廣泛的研究并取得了矚目的成績(jī)，但由于ET對(duì)機(jī)體系統(tǒng)、器官作用的廣泛性，至今對(duì)內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機(jī)理仍不完全明確，國(guó)內(nèi)療效確切、毒副作用小、價(jià)格低廉的抗內(nèi)毒素血癥療法也很少。 一百多年來，雖然闡明了ET 的化學(xué)本質(zhì)結(jié)構(gòu)，深入研究了ET與機(jī)體的相互作用，對(duì)內(nèi)毒素性疾病尤其是內(nèi)毒素性休克的發(fā)生機(jī)理也有了許多深入廣泛的認(rèn)識(shí)，但是由于內(nèi)毒素休克發(fā)生機(jī)理的復(fù)雜性，導(dǎo)致臨床上對(duì)內(nèi)毒素性休克及由此引起的多器官功能衰竭的治療效果依然不如人意，內(nèi)毒素休克的病死率仍居高不下。這說明內(nèi)毒素休克發(fā)生機(jī)理亟待更深入的研究。特別是研究凋亡在內(nèi)毒素體外介導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響，有利于更深入全面的闡明內(nèi)毒素誘發(fā)的疾病機(jī)制。近年來，國(guó)內(nèi)主要從事ET致細(xì)胞凋亡方面的研究有：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究室的李麗萍等，對(duì)關(guān)于氨基胍在內(nèi)毒素性肺損傷中起何作用作了研究；復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院的周曉瑜等關(guān)于內(nèi)毒素在小鼠過敏性哮喘模型所起的作用進(jìn)行了探討；浙江杭州市中醫(yī)院的鄭文龍等對(duì)慢性阻塞性肺疾病血瘀癥與內(nèi)毒素、內(nèi)皮素的關(guān)系進(jìn)行了研究探討；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的祝偉等就己酮可可堿在內(nèi)毒素血癥大鼠模型中心肌HSP70和NF-κB表達(dá)中有何影響做了探討研究；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的李敬等采用脂多醣致小鼠死亡實(shí)驗(yàn)研究板藍(lán)根的抗內(nèi)毒素作用。機(jī)體的細(xì)胞凋亡系統(tǒng)極其復(fù)雜，各調(diào)節(jié)凋亡基因更多的是通過不同的凋亡途徑來共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。c-myc和Livin是目前研究較為深入的兩種凋亡相關(guān)基因。近來發(fā)現(xiàn)c-myc基因與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，實(shí)驗(yàn)證明，c-myc與TNF誘導(dǎo)的凋亡過程可因Bcl-2蛋白的異位表達(dá)而受到限制，Bcl-2能阻止由c-myc基因引起的細(xì)胞凋亡，Bcl-2的相伴活動(dòng)能取消c-myc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響等等。但是內(nèi)毒素對(duì)肝臟細(xì)胞凋亡過程中c-myc基因和Livin基因的表達(dá)變化及它們之間相互作用影響對(duì)肝細(xì)胞凋亡有何表達(dá)變化，目前尚未弄清楚。
