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基本信息
- 項目名稱：
- 人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4成熟肽序列在畢赤酵母中的高效表達(dá)、純化和活性檢測
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 根據(jù)畢赤酵母高表達(dá)基因?qū)μ囟艽a子偏好的特性，選擇畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，替換人BMP-4成熟肽序列在畢赤酵母高表達(dá)基因中不常用的密碼子，優(yōu)化設(shè)計人BMP-4成熟肽表達(dá)序列并構(gòu)建重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌和篩選高表達(dá)菌株；利用色譜純化技術(shù)設(shè)計純化路線，純化重組人BMP-4；對純化的重組蛋白進(jìn)行生理活性檢測。
- 詳細(xì)介紹：
- 目的：骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4，BMP4）是一種生長因子，具有明顯促進(jìn)細(xì)胞組織分化為骨組織的能力，在骨缺損、骨折的修復(fù)和脊柱融合等眾多方面的骨科臨床上有很高的應(yīng)用價值。從哺乳動物骨骼材料中提取的天然BMP-4數(shù)量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在臨床上的應(yīng)用。為此，我們建立了人BMP-4在畢赤酵母中的高效表達(dá)及純化工藝。 方法：根據(jù)畢赤酵母高表達(dá)基因?qū)μ囟艽a子偏好的特性，選擇畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，替換人BMP-4成熟肽序列在畢赤酵母高表達(dá)基因中不常用的密碼子，優(yōu)化設(shè)計人BMP-4成熟肽表達(dá)序列并構(gòu)建重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌和篩選高表達(dá)菌株；利用色譜純化技術(shù)設(shè)計純化路線，純化重組人BMP-4；對純化的重組蛋白進(jìn)行生理活性檢測。 結(jié)果：控制表達(dá)序列A+T含量在30-55%的范圍內(nèi)，盡可能使用畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，優(yōu)化設(shè)計人BMP-4表達(dá)序列，使人BMP-4的表達(dá)水平提高了4倍，在搖瓶表達(dá)中產(chǎn)量能達(dá)到48mg/L。發(fā)酵上清中的重組人BMP-4用SP Sepharose和heparin親和色譜層析法進(jìn)行純化。對純化后的人BMP-4進(jìn)行生理活性的檢測，結(jié)果顯示重組人BMP-4能異位誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的生成和增加效應(yīng)細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性，具有生理活性。 結(jié)論：通過對人BMP-4表達(dá)序列的優(yōu)化設(shè)計，有效地解決了人BMP-4在畢赤酵母中表達(dá)量低的問題，同時建立了重組人BMP4純化工藝，并證明畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的人重組BMP-4具有明顯的生理活性，為人BMP-4進(jìn)一步的臨床應(yīng)用開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 天然提取的BMP-4數(shù)量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在臨床上的應(yīng)用。為此，我們建立了人BMP-4在畢赤酵母中的高效表達(dá)及純化工藝。選擇畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，替換人BMP-4成熟肽序列在畢赤酵母高表達(dá)基因中不常用的密碼子，優(yōu)化設(shè)計人BMP-4成熟肽表達(dá)序列并構(gòu)建重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌和篩選高表達(dá)菌株；純化重組人BMP-4；對純化的重組蛋白進(jìn)行生理活性測。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 利用畢赤酵母使用的高頻密碼子替換hBMP-4成熟肽序列中的低頻密碼子并控制其序列的A+T含量在30-55%水平，人工設(shè)計一條hBMP-4成熟肽優(yōu)化序列。優(yōu)化序列通過人工合成并在畢赤酵母中實現(xiàn)高效表達(dá)。與原序列相比，密碼子優(yōu)化后序列使hBMP-4的表達(dá)產(chǎn)量提高了4倍，通過色譜法純化hBMP-4，建立了純化工藝。而純化后hBMP-4顯示出可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的形成和增加堿性磷酸酶的生物活性。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- BMPs是一類廣譜性的蛋白質(zhì)生長調(diào)節(jié)因子，在臨床醫(yī)學(xué)有很好應(yīng)用前景。但是天然提取的BMPs產(chǎn)量低，費(fèi)用高，無法很好的應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)上。本研究通過優(yōu)化密碼子的手段，使hBMP-4在畢赤酵母中表達(dá)產(chǎn)量提高了4倍，且通過色譜層析法純化得到BMP-4并對純化后的hBMP-4的生理活性進(jìn)行鑒定，從而得到高表達(dá)，純化的，有活性的BMP-4。為進(jìn)一步開展臨床應(yīng)用的研究和將來可能的臨床應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 在最初的表達(dá)研究中，我們將原始的hBMP-4成熟肽序列在畢赤酵母中表達(dá)。盡管hBMP-4在非常強(qiáng)的酵母啟動子AOX1控制下表達(dá)，但其在搖瓶培養(yǎng)中表達(dá)量較低。為了提高h(yuǎn)BMP-4的表達(dá)水平，我們利用酵母高表達(dá)基因使用的高頻密碼子替換了hBMP-4原序列中低頻密碼子，設(shè)計一條表達(dá)序列。該序列只含有酵母偏好的密碼子，同時A+T含量被控制在30-55%的范圍內(nèi)。密碼子優(yōu)化后使hBMP-4的表達(dá)水平提高了4倍，在搖瓶表達(dá)中產(chǎn)量達(dá)到48mg/L。發(fā)酵上清中的重組hBMP-4用SP Sepharose和heparin親和色譜層析法進(jìn)行純化。對純化后的rhBMP-4進(jìn)行生理活性的檢測，結(jié)果顯示rhBMP-4能誘導(dǎo)異位軟骨細(xì)胞的產(chǎn)生和增加效應(yīng)細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- [1] Shore EM, Xu M, Shah PB, Janoff HB, Hahn GV, Deardorff MA, Sovinsky L, Spinner NB, Zasloff MA, Wozney JM, Kaplan FS. The human bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) gene: molecular structure and transcriptional regulation. Calcif Tissue Int 63(3): 221-229.1998. [2] Selever J, Liu W, Lu MF, Behringer RR, Martin JF.Bmp4 in limb bud mesoderm regulates digit pattern by controlling AER development. Dev Biol 15;276(2): 268-279. 2004. [3] Hosoya A, Kim JY, Cho SW, Jung HS. BMP4 signaling regulates formation of Hertwig's epithelial root sheath during tooth root development. Cell Tissue Res 333(3) :503-509. 2008. [4] Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol 16(1) :23-52. 2000. [5] Cereghino GP, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol 13(4): 329-332. 2002.
同類課題研究水平概述
- 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)，是一類廣譜性的蛋白質(zhì)生長調(diào)節(jié)因子，其全長cDNA約為1.2 kb，轉(zhuǎn)錄、翻譯后具有生理活性的分子是一類磷酸化的二聚體糖蛋白多肽分子。已有的研究表明BMPs不僅對器官的發(fā)育起關(guān)鍵的作用，而且對骨質(zhì)的生長、神經(jīng)細(xì)胞的再生、創(chuàng)口愈合以及神經(jīng)腫瘤的治療等均有明顯的促進(jìn)功能。 國內(nèi)研究機(jī)構(gòu)多利用原核系統(tǒng)表達(dá)BMPs 。利用原核系統(tǒng)表達(dá)的BMPs要經(jīng)過煩瑣的變性和復(fù)性過程。對于結(jié)構(gòu)較復(fù)雜BMPs分子(有六個鏈內(nèi)二硫鍵和一個鏈間二硫鍵)，復(fù)性的成功率很低，并且原核系統(tǒng)無法使表達(dá)的BMPs進(jìn)行糖基化加工，因此利用原核系統(tǒng)表達(dá)的BMPs在生理活性上必將受到影響。國外研究機(jī)構(gòu)則利用哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)BMPs。哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)能表達(dá)出高活性的天然構(gòu)象BMPs，但其表達(dá)量低，需要昂貴的設(shè)備和培養(yǎng)基，使得利用哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的BMPs成本很高。 為了避免以上兩種表達(dá)系統(tǒng)對hBMP-4表達(dá)的影響，本課題選用了畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母(Pichia pastoris)是單細(xì)胞真核生物，它既有原核生物生長快、培養(yǎng)容易、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，同時，因其是真核生物，又能對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾，使表達(dá)的外源蛋白具有較高的生物學(xué)活性，因此，非常適合真核蛋白的表達(dá)。2000年之前已有400多種外源蛋白在畢赤酵母中成功表達(dá)，2002年以后，在Pichia pastoris中表達(dá)的外源蛋白又增加了40多種。 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)雖然具有以上的許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在著一些缺陷。其中之一是由于物種間對密碼子偏好的不同造成有些外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量過低。為了提高h(yuǎn)BMP-4的表達(dá)量，本課題對hBMP-4序列進(jìn)行優(yōu)化，研究其對hBMP-4在畢赤酵母中表達(dá)水平的影響。我們的研究結(jié)果也為其它外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)提供借鑒。
