基本信息
- 項目名稱：
- 人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子（VEGI）的結(jié)構(gòu)與功能學(xué)初步研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本課題探討血管內(nèi)皮生長抑制因子（VEGI-192）的結(jié)構(gòu)和功能學(xué)關(guān)系，首次發(fā)現(xiàn)VEGI-192蛋白具有形成多聚體空間結(jié)構(gòu)的特性；通過體內(nèi)、體外抗血管新生實驗，證明了VEGI-192蛋白多聚體的結(jié)構(gòu)形式可能為其生物學(xué)活性形式；同時以整合素αvβ3為腫瘤靶點，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，VEGI-192蛋白為抗腫瘤效應(yīng)分子，成功構(gòu)建靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192。
- 詳細介紹：
- 本課題組成員自2008年開始研究一種更加高效穩(wěn)定的蛋白表達系統(tǒng)和純化復(fù)性方法，目前已成功建立VEGI-192蛋白的新型自動誘導(dǎo)原核表達系統(tǒng)及蛋白制備新工藝，并能高效穩(wěn)定地表達高產(chǎn)量、高純度、高活性及可溶性好的VEGI-192重組蛋白。因為本系統(tǒng)自身的獨特設(shè)計，可以為重組蛋白在宿主菌中提供均衡氧化還原勢能，以利于蛋白的正確空間折疊，應(yīng)用該自動誘導(dǎo)系統(tǒng)表達的VEGI-192重組蛋白在產(chǎn)量、可溶性、活性等方面均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)IPTG誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。而在蛋白純化過程中，通過Western blotting檢測方法比較兩個系統(tǒng)獲得的VEGI-192重組蛋白條帶的異同，我們發(fā)現(xiàn)自誘導(dǎo)系統(tǒng)存在的豐富的多聚體形態(tài)，于是，我們提出一個假設(shè)：VEGI-192蛋白具有形成多聚體空間結(jié)構(gòu)的特性，并且研究證明這種多聚體的結(jié)構(gòu)形式可能為其生物學(xué)活性形式。 我們發(fā)現(xiàn)，進行非還原SDS-PAGE后再進行Western Blotting檢測來進一步分析鑒定自誘導(dǎo)表達系統(tǒng)純化的VEGI-192蛋白，有兩條蛋白條帶清晰可見，我們推測這很可能便是VEGI-192的多聚體條帶。為了進一步驗證排除非特異條帶的可能性，我們充分煮沸使VEGI-192變性后再次進行Western Blotting分析，結(jié)果顯示無多聚體蛋白條帶，這從一方面面證明了VEGI-192存在多聚體的結(jié)構(gòu)形式。同時，我們將VEGI-192用非還原SDS-PAGE后再進行考馬斯亮藍染色，切下處于上方的多聚體條帶作質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示該條帶即為VEGI-192蛋白，這充分證明了VEGI-192存在多聚體的結(jié)構(gòu)形式。目前我們正開展對VEGI-192蛋白的結(jié)晶實驗，擬進行X-射線晶體衍射實驗對其多聚體結(jié)構(gòu)進行更為詳盡的鑒定。 我們發(fā)現(xiàn)了自誘導(dǎo)系統(tǒng)制備的重組蛋白的多聚體量更多，進而通過采用MTT比色試驗法和Annexin V細胞染色分析結(jié)合流式細胞術(shù)檢測VEGI-192重組蛋白在不同多聚體形態(tài)下的體外抑制內(nèi)皮細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡的生物學(xué)活性。同時應(yīng)用雞胚絨毛尿囊血管新生抑制實驗測定兩者體內(nèi)抑制血管新生活性，我們發(fā)現(xiàn)多聚體含量越高的VEGI-192重組蛋白其抗血管新生的生物學(xué)活性更強。這充分證明VEGI-192蛋白形成的多聚體的空間結(jié)構(gòu)可能為其生物學(xué)活性形式。 同時在VEGI-192蛋白的結(jié)構(gòu)改造與修飾方面，我們引入RGD多肽與VEGI-192形成嵌合蛋白，擬探討RGD的嵌合改造是否能增強VEGI-192的功效。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，作為整合素和其配體相互作用的識別位點, 介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)及細胞之間的相互作用。腫瘤細胞或者新生血管可以特異表達某些整合素如αvβ3，能以一定的親和力結(jié)合RGD肽,成為腫瘤治療的新靶點。因此,RGD 肽在腫瘤治療中的應(yīng)用已成為研究熱點。RGD肽可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而且作為載體在腫瘤靶向治療中發(fā)揮重要作用。而目前在VEGI蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)、作用機理和藥理學(xué)性質(zhì)沒有完整清晰的了解的情況下，我們擬構(gòu)建靶向性更強的嵌合重組蛋白RGD-VEGI-192，以整合素αvβ3為腫瘤靶點，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，VEGI-192蛋白為抗腫瘤效應(yīng)分子，構(gòu)建靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192，并檢測其生物學(xué)活性，為深入探討RGD-VEGI-192的體內(nèi)靶向抑瘤活性及腫瘤治療應(yīng)用前景奠定基礎(chǔ)。同時豐富了VEGI-192在腫瘤治療中的應(yīng)用形式，為腫瘤靶向治療提供了新思路。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 血管內(nèi)皮生長抑制因子（VEGI）是一種新型高效的內(nèi)源性血管新生拮抗劑，本課題通過研究血管內(nèi)皮生長抑制因子新亞型（VEGI-192）的三維空間結(jié)構(gòu)和功能學(xué)關(guān)系；同時進行VEGI-192基因結(jié)構(gòu)修飾改造，以獲得抗血管新生活性更好的VEGI-192重組蛋白RGD-VEGI-192，為其作為臨床藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 本課題首次發(fā)現(xiàn)VEGI-192蛋白具有形成多聚體空間結(jié)構(gòu)的特性，并且研究證明這種多聚體的結(jié)構(gòu)形式可能為其生物學(xué)活性形式。同時首次以整合素αvβ3為腫瘤靶點，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，VEGI-192蛋白為抗腫瘤效應(yīng)分子，成功構(gòu)建靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192。目前著眼于兩個領(lǐng)域已進行專利申請以及論文發(fā)表。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- VEGI是一種新型血管新生抑制劑。研究表明其對多種腫瘤均有抑制效果，且毒副作用低，有巨大的臨床應(yīng)用前景。其與目前臨床使用的thalidomidle，avastin和cartcell抗腫瘤原理相似。而本研究為其制劑推向新藥臨床試驗打下基礎(chǔ)。即使在臨床早期，單藥治療療效未能充分確立時，因其抗腫瘤機制與傳統(tǒng)的放化療相異，與多種傳統(tǒng)方案聯(lián)合使用有望觀察到協(xié)同作用。故本研究有望創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟和社會價值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：探討血管內(nèi)皮生長抑制因子（VEGI-192）結(jié)構(gòu)和功能學(xué)關(guān)系，通過基因改造獲得抗血管新生活性更高的RGD-VEGI-192蛋白。 方法：采用非還原SDS-PAGE，Western blotting及質(zhì)譜技術(shù)驗證VEGI-192多聚體的存在。MTT比色法和Annexin V細胞染色分析結(jié)合流式細胞術(shù)檢測VEGI-192不同多聚體形態(tài)下體外抑制內(nèi)皮細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的活性。應(yīng)用雞胚絨毛尿囊血管新生抑制實驗測定兩者體內(nèi)抑制血管新生的活性。PCR擴增RGD-VEGI-192融合基因并獲得RGD-VEGI-192蛋白，鑒定其體外抗血管新生活性。 結(jié)果：Western blotting及質(zhì)譜技術(shù)驗證了VEGI-192的多聚體形態(tài)，MTT比色法和Annexin V細胞染色分析證明多聚體數(shù)量與其抑制內(nèi)皮細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡功效成正相關(guān)。成功構(gòu)建RGD-VEGI-192融合基因并獲得RGD-VEGI-192蛋白，證明其活性高于VEGI-192。 結(jié)論：首次發(fā)現(xiàn)VEGI-192具有多聚體結(jié)構(gòu)，并證明多聚體可能為其生物學(xué)活性形式。通過首創(chuàng)性基因修飾改造獲得活性更高的RGD-VEGI-192。
獲獎情況
- 1.本論文部分結(jié)果已發(fā)表于SCI雜志《Protein Science》，影響因子2.9，本課題組成員劉漢凝同學(xué)為共同第一作者。 2.本課題組構(gòu)建的VEGI-192蛋白的新型自動誘導(dǎo)原核表達系統(tǒng)及蛋白制備新工藝的專利申請已獲國家知識產(chǎn)權(quán)局予以受理，申請?zhí)枮?00910037702.6。 3.本課題組構(gòu)建的靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192表達克隆專利申請已獲國家知識產(chǎn)權(quán)局予以受理，申請?zhí)枮?00910037701.1。 4.本作品獲我校第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)作品大賽一等獎。 5.本作品獲廣東省第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)作品大賽特等獎。
鑒定結(jié)果
- 該作品系學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品，符合要求。
參考文獻
- [1] Holleb AI, Folkman J.Tumor angiogenesis. CA-Cancer-J-Clin, 1972, 22(4): 226-9 [2] Oku Naoto, Asai Tomohiro, Watanabe Koh, et al.Anti-neovascular therapy using novel peptides homing to angiogenic vessels. Oncogene, 2002, 21(17): 2662-9 [3] [4] Zhai Y, Yu j, Iruela Al, Huang WQ, et al. Inhibition of angiogenesis and breast cancer xenograft tumor growth by VEGI, a novel cytokine of the TNF superfamily . Int J Cancer 1999;82:131-6 [5] Zhai et al, A novel cytokine of the tumor necrosis factor family ,is an angiogenesis inhibitor that suppresses the growth of colon carcinomas in vivo. FASEB J 1999;13:181-9 [6] Hou W, Medynske D, Wu S, Lin X, Li LY. VEGI-192, a New Isoform of TNFSF15, Specifically Eliminates Tumor Vascular Endothelial Cell and Suppresses Tumor Growth . Clin Cancer Res 2005,11(5):5595-5602
同類課題研究水平概述
- 血管內(nèi)皮生長抑制因子（VEGI）是新發(fā)現(xiàn)的血管新生拮抗劑，屬腫瘤壞死因子超家族，Ⅱ型跨膜糖蛋白。人VEGI基因以不同的剪接方式形成三種異構(gòu)體：VEGI-174、VEGI-192和VEGI-251。研究發(fā)現(xiàn)VEGI-192顯著抑制牛動脈內(nèi)皮細胞與人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，在三種拼接異構(gòu)體中最高，對人冠狀動脈平滑肌細胞及鼠路易士肺癌細胞等無抑制增殖作用。VEGI-192還能抑制內(nèi)皮細胞形成管狀結(jié)構(gòu)。體內(nèi)實驗顯示，系統(tǒng)性腹腔注射VEGI-192有效抑制異體移植腫瘤生長，腫瘤血管化程度顯著降低，且顯示無肝腎毒性。研究發(fā)現(xiàn)VEGI對不同的腫瘤模型如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等都具有顯著的抗腫瘤療效。 研究發(fā)現(xiàn)VEGI的作用機制包括：（1）對不同細胞周期的血管內(nèi)皮細胞的作用：VEGI使G0/G1期內(nèi)皮細胞生長停滯；對增殖期的內(nèi)皮細胞則誘導(dǎo)其凋亡。（2）調(diào)節(jié)免疫。VEGI全身給藥后，各種細胞因子血濃度明顯上調(diào)，脾內(nèi)淋巴細胞數(shù)量增加，骨髓造血祖細胞動員。體外培養(yǎng)可激活NK細胞和樹突狀細胞。（3）影響血管形成。此方面影響正在研究中。（4）受體（或配體）及作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。受體不明，研究顯示VEGI-251可與腫瘤壞死因子受體家族中的死亡受體3(death receptor 3，DR3)或誘騙受體3(decoy receptor 3，DcR3)結(jié)合而啟動不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 VEGI基因發(fā)現(xiàn)至今，其分子受體、蛋白三維結(jié)構(gòu)注釋及作為抗腫瘤制劑臨床前研究方面一直停滯不前，根本原因為其純化制備所得蛋白往往形成沉淀。這主要因為該蛋白：（1）含兩個半胱氨酸，推測其正確折疊需二硫鍵形成。（2）等電點為7.8，非常接近人的生理pH及常規(guī)中性緩沖溶劑，易在溶劑中聚集沉淀。（3）為Ⅱ型跨膜糖蛋白，疏水性大，體外表達純化技術(shù)一直有待改善。以往研究制備的VEGI產(chǎn)量、可溶性和活性均不理想，極大地限制了其結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用。 RGD肽是1984年由Pierschbacher和Ruoslahti發(fā)現(xiàn)的一類含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，存在于多種生物體的各種組織中，作為整合素和其配體相互作用的識別位點，介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)及細胞之間的相互作用。腫瘤細胞或新生血管可特異表達某些整合素如αvβ3，以一定親和力結(jié)合RGD肽，成為腫瘤治療的新靶點。
