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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 石斑魚抗菌肽的分離純化及其活性分析
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 利用致病性哈氏弧菌經(jīng)腹腔注射對(duì)布氏石斑魚進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，其頭腎粗提物具有較好的抑菌活性。利用電泳凝膠瓊脂糖彌散法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，頭腎粗提物中含有多種對(duì)大腸桿菌D31有較強(qiáng)抑制作用的蛋白類抗菌物質(zhì)；切膠回收AU-PAGE凝膠上的抗菌組分，利用SDS-PAGE凝膠檢測(cè)各抗菌活性組分的分子量，利用491制備型電泳槽對(duì)布氏石斑魚頭腎粗提物進(jìn)行分離純化。
- 詳細(xì)介紹：
- 石斑魚是海南水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要對(duì)象，隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，養(yǎng)殖病害日益嚴(yán)重?？股赜心退幮裕幬餁埩舻热秉c(diǎn)，因此選擇對(duì)抗菌肽的研究來(lái)提高養(yǎng)殖質(zhì)量。而石斑魚抗菌肽的分離純化研究較少，主要集中在基因克隆方面的研究，因此我們選擇布氏石斑魚作為研究對(duì)象。利用致病性哈氏弧菌（Vibrio harveyi）經(jīng)腹腔注射對(duì)布氏石斑魚（Epinephelus bleekeri）進(jìn)行誘導(dǎo)刺激18h，其頭腎粗提物具有較好的抑菌活性，不僅可抑制金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等革蘭氏陽(yáng)性菌，也可抑制大腸桿菌D31（Escherichia coli D31）、哈氏弧菌和溶藻弧菌(V. alginolyticus)等革蘭氏陰性菌；利用電泳凝膠瓊脂糖彌散法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，頭腎粗提物中含有多種對(duì)大腸桿菌D31有較強(qiáng)抑制作用的蛋白類抗菌物質(zhì)；切膠回收AU-PAGE凝膠上的抗菌組分，利用SDS-PAGE凝膠檢測(cè)各抗菌活性組分的分子量大小依次約為10.9KD、10.0KD、8.1KD、7.2KD、6.3KD，利用491制備型電泳槽對(duì)布氏石斑魚頭腎粗提物進(jìn)行分離純化，其效果要優(yōu)于一般使用的層析法分離抗菌肽的方法，為為今后利用高壓液相色譜進(jìn)行分離純化奠定了良好的基礎(chǔ)。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 撰寫目的：本作品選取海南經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種布氏石斑魚作為研究對(duì)象，旨在從頭腎分離得到新型抗菌肽，為后期新型藥物開(kāi)發(fā)，控制病害提供依據(jù)。 基本思路：從布氏石斑魚頭腎分離得到粗提物，進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)及活性物質(zhì)性質(zhì)分析，確定為蛋白類活性物質(zhì)后，通過(guò)AU-PAGE電泳和SDS-PAGE電泳進(jìn)行純化和分子量測(cè)定；同時(shí)粗提物進(jìn)行491制備型電泳槽分離純化的探索，希望為今后抗菌肽的提取提供新的方法。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 科學(xué)性：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程參考并總結(jié)了大量國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)步驟相互驗(yàn)證。先進(jìn)性：石斑魚是我國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。但有關(guān)其抗菌肽等抗菌蛋白類物質(zhì)的研究并不多。大部分石斑魚抗菌肽的研究都集中在基因克隆方面，特別是布氏石斑魚在分離提取方面的研究少有報(bào)道。獨(dú)特之處：在抗菌肽的分離中，使用491制備型電泳槽進(jìn)行抗菌肽的分離提純，比傳統(tǒng)使用的層析法效果更好，目前在國(guó)內(nèi)使用此方法的并不多。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 抗菌肽是被認(rèn)為是最有可能替代現(xiàn)有抗生素用于疾病防治的新型抗菌藥物。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害防治方面具有巨大的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果不僅有助于揭示石斑魚的免疫機(jī)制，為控制其病害探索合適方法，還有助于從石斑魚中發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)活性的新型抗菌肽類，擴(kuò)展整個(gè)魚類抗菌肽的研究深度和廣度，從而為研究具有良好活性且具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的病害控制新藥奠定基礎(chǔ)，并推動(dòng)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型抗感染藥物和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 利用致病性哈氏弧菌（Vibrio harveyi）經(jīng)腹腔注射對(duì)布氏石斑魚（Epinephelus bleekeri）進(jìn)行誘導(dǎo)刺激18h，其頭腎粗提物具有較好的抑菌活性，不僅可抑制金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等革蘭氏陽(yáng)性菌，也可抑制大腸桿菌D31（Escherichia coli D31）、哈氏弧菌和溶藻弧菌(V. alginolyticus)等革蘭氏陰性菌；利用電泳凝膠瓊脂糖彌散法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，頭腎粗提物中含有多種對(duì)大腸桿菌D31有較強(qiáng)抑制作用的蛋白類抗菌物質(zhì)；切膠回收AU-PAGE凝膠上的抗菌組分，利用SDS-PAGE凝膠檢測(cè)各抗菌活性組分的分子量大小依次約為10.9KD、10.0KD、8.1KD、7.2KD、6.3KD，利用491制備型電泳槽對(duì)布氏石斑魚頭腎粗提物進(jìn)行分離純化，未達(dá)到很好的分離效果，其分離條件尚需進(jìn)一步優(yōu)化。
獲獎(jiǎng)情況
- 省級(jí)“挑戰(zhàn)杯”全國(guó)大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽二等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- [1] OREN Z, SHAI Y. A class of highly potent antibacterial peptides derived from pardaxin, a pore-forming peptide isolated from Moses sole fish Pardachirus marmoratus [J]. European Journal of Biochemisty, 1996, 237:303~310. [2] PAN C Y, CHEN J Y, NI I H. et al. Organization and promoter analysis of the grouper (Epinephelus coioides) epinecidin-1 gene [J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B,2008,150: 358–367. [3] VEGA E, O’LEARY N A, SHOCKEY J E, et al. Anti-lipopolysaccharide factor in Litopenaeus vannamei (LvALF): A broad spectrum antimicrobial peptide essential for shrimp immunity against bacterial and fungal infection [J]. Molecular Immunology, 2008,45:1916-1925.. [4] SILPHADUANG U, NOGA E J. 2001. Antimicrobials: Peptide antibiotics in mast cells of fish [J]. Nature, 414: 268-269. [5] PANYIM S, CHALKLEY R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histone [J]. Archives of Biochemisty and Biophysics,1969,130:337.
同類課題研究水平概述
- 自上世紀(jì)八、九十年代以來(lái)，相關(guān)人員主要采用分離純化和測(cè)序的模式得到了約20多種的魚類抗菌肽，主要有泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）的misgurin，美洲擬鰨（Pleuronecte americanus）的piscidins和Bass hepcidin，豹鰨（Pardachirus marmoratus）的pardaxins，斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的HbβP，鯉魚（Cyprimus carpio）的糖基化抗菌肽等(Park et al,1997; Cole et al,1997; Lemaitre et al,1996; Oren et al,1996)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷成熟，研究人員采用分子生物學(xué)的技術(shù)手段進(jìn)行魚類抗菌肽的基因克隆相關(guān)研究，至今已從幾十種魚類克隆到相當(dāng)豐富的抗菌肽同源基因。斑點(diǎn)叉尾鮰（I. punctatus）的NK-lysin，真鯛（Chrysophrys major）、南極魚（Dissostichus mawsoni）等多種魚類的hepcidin，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）的epinecidin-1等(Chen et al. 2005; Wang et al,2006; Yin et al. 2006; Xu et al. 2008)。目前廣泛采用的包括cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和EST序列測(cè)定等分子生物學(xué)技術(shù)在對(duì)魚類各種同源基因的鑒定方面有著非常大的作用，但對(duì)新型魚類抗菌肽的鑒定仍有點(diǎn)力不從心。所以對(duì)于新型魚類抗菌肽還必須采用傳統(tǒng)的分離純化和測(cè)序模式來(lái)進(jìn)行。抗菌肽的分離純化，目前常用的是先用層析系統(tǒng)初分，再用高壓液相色譜（HPLC）進(jìn)一步純化，但用層析系統(tǒng)存在一個(gè)顯著缺陷，即容易丟失含量較少和分子量較小的成分，而這類抗菌肽往往活性高、易合成，開(kāi)發(fā)潛力大。美國(guó)北卡州立大學(xué)Noga教授實(shí)驗(yàn)室對(duì)層析系統(tǒng)和491制備型電泳槽分離抗菌肽效果的比較研究表明，后者能更好地保存樣品中的活性成分，可有效避免活性成分丟失的問(wèn)題，更容易分離獲得魚類的新型抗菌肽。本文即采用該方法對(duì)石斑魚的抗菌肽進(jìn)行分離純化，期望從石斑魚中發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)活性的新型抗菌肽類，為研究具有良好活性且具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的病害控制新藥奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論和實(shí)際意義。
