作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：探索溫度敏感型環(huán)糊精對天然蛋白質（溶菌酶）的復性效率及復性機理。思路：將經過溫敏化合物聚(N-異丙基丙烯酰胺)改性后的β-環(huán)糊精用于溶菌酶的復性，通過比較本研究中制備的EDA-CD、PNIPA-COOH和β-CD-PNIPA對于溶菌酶復性的影響考察β-CD-PNIPA單獨用于溶菌酶復性的可能性，并采用熒光光譜法研究了β-CD-PNIPA與溶菌酶的相互作用機理。
科學性、先進性及獨特之處
- 1.將具有環(huán)境響應型的β-環(huán)糊精單獨作為人工分子伴侶直接輔助用于溶菌酶的復性，這是以往的研究較少涉足的。 2.將三種不同類型的β-環(huán)糊精與表面活性劑組成人工分子伴侶系統(tǒng)，探討在溶菌酶的復性過程中二者的協(xié)同作用。 3.采用圓二色譜法及熒光光譜法研究溶菌酶的復性過程，探討在復性過程中β-環(huán)糊精的存在對蛋白質的二級結構的影響，并分析溶菌酶的復性動力學過程，探索其折疊機理。
應用價值和現實意義
- 本作品著眼于當前生物化學領域的熱點——蛋白質復性中存在的一些問題，合成了一種新型的功能型的環(huán)糊精衍生物用于變性蛋白質的復性，在一定程度上解決了在傳統(tǒng)蛋白質復性研究中復性收率普遍較低以及復性完成后復性劑與蛋白質的分離問題。從研究結果來看，達到了研究者的設計要求，具有較高的實際應用和推廣價值。
學術論文摘要
- 用溫敏化合物聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPA-COOH）改性β-環(huán)糊精，通過評估β-CD-PNIPA、EDA-CD和PNIPA-COOH對經尿素變性的溶菌酶的復性效果，從而證實是否可將β-CD-PNIPA單獨用于輔助蛋白質復性。結果顯示，加入EDA-CD、PNIPA-COOH或β-CD-PNIPA后，溶菌酶復性率均高于直接稀釋時溶菌酶的復性率。特別地，單獨加入β-CD-PNIPA時溶菌酶的復性率最高，但略低于將β-CD-PNIPA和CTAB按最佳順序加入到復性液中時。最好在低于β-CD-PNIPA的Lower critical solution temperature（LCST）的溫度條件下將β-CD-PNIPA用于輔助蛋白質復性。β-CD-PNIPA與溶菌酶的相互作用是通過熒光發(fā)射光譜表征的?；谝陨辖Y果，β-CD-PNIPA可單獨用于輔助蛋白質復性，也可與CTAB聯(lián)合用于輔助蛋白質復性。加入β-CD-PNIPA后溶菌酶的復性得到了改進，這是因為β-CD空穴對溶菌酶分子具有包絡作用以及溶菌酶分子與PNIPA片段間存在疏水作用。
獲獎情況
- 我校課外學術科技節(jié)一等獎 我省青年學術科技節(jié)一等獎
鑒定結果
- 無
參考文獻
- （1）β-環(huán)糊精的溫敏改性技術檢索文獻：T. Nozaki, Y. Maeda, K. Ito, H. Kitano, Cyclodextrins Modified with Polymer Chains Which Are Responsive to External Stimuli, Macromolecules, 1996, 285: 22-524. （2）溶菌酶變性技術檢索文獻：A. Desai, C. Lee, L. Sharma, A. Sharma, Lysozyme renaturation with cyclodextrins: structure– activity relationship, Biochimie, 2006, 88: 1435–1445. （3）溶菌酶活性的測定技術檢索文獻：P. Jolles, Preparation and assay of enzymes. Meth. Enzymol, 1962, 5: 12–13.
同類課題研究水平概述
- 由于環(huán)糊精分子中含有疏水性空腔，客體分子能從寬口端進入其分子空腔形成包絡化合物。因此在使用表面活性劑輔助蛋白質復性時，常常需要加入環(huán)糊精以剝離與蛋白質形成膠束的表面活性劑或去污劑。Karuppiah等人發(fā)現，向鹽酸胍變性的碳酸脫水酶(CAB)復性稀釋液中加入適量β-環(huán)糊精(β-CD)可使其復性率超過90%。他們認為這是由于環(huán)糊精的疏水性空腔與蛋白質復性中間體的疏水性位點發(fā)生了相互作用。聚(N-異丙基丙烯酰胺) (PNIPA )是一種具有溫度敏感性的聚合物，其相轉變溫度(Lower critical solution temperature，LCST)在32 ℃附近。Lin等人曾將PNIPA用于輔助β-lactamase的復性，發(fā)現其復性效率比PEG更高，使用PNIPA可使經鹽酸胍變性的β-lactamase的活性率提高41％，而PEG只能提高26％。Lu等人曾采用SDS–PAGE, 圓二色譜和熒光光譜等方法研究了PNIPA對尿素變性溶菌酶的復性機理，認為PNIPA對溶菌酶的復性作用是因為PNIPA增強了蛋白質的二級結構并抑制了溶菌酶的聚集作用，從而促進蛋白質的復性。將β-CD與PNIPA耦聯(lián)，制備具有溫度敏感的β-環(huán)糊精衍生物(β-CD-PNIPA)主要被用于藥物釋放系統(tǒng)的研究。雖然Lu等人曾將該體系用于溶菌酶的復性，但偶聯(lián)產物中的β-CD結構單元主要用于剝離表面活性劑CTAB，而未考察其對溶菌酶的復性作用。結合Karuppiah等人的研究，我們認為，β-CD-PNIPA用于輔助蛋白質復性時，其分子中PNIPA鏈段及環(huán)糊精的疏水性空腔應當可以同時促進溶菌酶的復性，即具有協(xié)同輔助蛋白質復性的作用。
