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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 用于質(zhì)粒篩選的新型熒光載體構(gòu)建
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 利用綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，構(gòu)建一種新型的質(zhì)粒載體，可以通過激發(fā)光照射后有無熒光產(chǎn)生進(jìn)行高效的重組質(zhì)粒篩選，建立了一種快捷可靠、低假陽假陰性、高通量的細(xì)菌重組質(zhì)粒篩選方法。這種融合熒光蛋白基因的新型質(zhì)粒載體構(gòu)建，不僅可以拓展綠色熒光蛋白的應(yīng)用范圍，而且為篩選細(xì)菌重組質(zhì)?？寺√峁┬碌募夹g(shù)方案。
- 詳細(xì)介紹：
- 摘 要 本研究主要內(nèi)容是構(gòu)建一種以綠色熒光蛋白（GFP）為報(bào)告基因的新型載體。實(shí)驗(yàn)用EcoRⅠ、NdeⅠ兩種酶對(duì)PUC19質(zhì)粒和GFP基因進(jìn)行雙酶切，將PUC19質(zhì)粒上的原報(bào)告基因LacZ片段切下后連入GFP基因，形成以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因的新型質(zhì)粒載體pGreenYU。新載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α，搖菌后發(fā)現(xiàn)菌液呈現(xiàn)出明顯的熒光。提取菌液中的質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切及PCR鑒定，結(jié)果證明，新型熒光載體pGreenYU構(gòu)建成功。 關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白（GFP）；新型載體； pGreenYU ；構(gòu)建 目 錄 1 前言 1 1.1 GFP簡(jiǎn)介 1 1.2質(zhì)粒篩選的一般方法 2 1.3本研究的意義 3 2 材料與方法 3 2.1材料 3 2.1.1 菌株 3 2.1.2 試劑 4 2.1.3 主要儀器 4 2.2方法 4 2.2.1 GFP基因的克隆 4 2.2.2 構(gòu)建融合GFP基因的重組質(zhì)粒pGreenYU 7 2.2.3對(duì)融合有GFP基因的重組質(zhì)粒pGreenYU進(jìn)行鑒定 10 3 結(jié)果與分析 12 3.1 GFP基因的克隆 12 3.2 PUC19質(zhì)粒酶切 12 3.3重組質(zhì)粒pGreenYU轉(zhuǎn)化后平板培養(yǎng)和菌液離心后的結(jié)果 13 3.4重組質(zhì)粒pGreenYU的雙酶切和PCR擴(kuò)增鑒定 14 4 討論 15 4.1 重組質(zhì)粒pGreenYU的優(yōu)點(diǎn) 15 4.2 重組質(zhì)粒pGreenYU的缺點(diǎn) 16 4.3 熒光法和藍(lán)白斑法的篩選效率 16 4.4 研究展望 17 參考文獻(xiàn) 19 1 前言 1.1 GFP簡(jiǎn)介 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是海洋中無脊椎刺胞動(dòng)物體中的一種天然蛋白。最早由Osamu Shimomura【1】于1962年在水母（Aequorea victoria）中發(fā)現(xiàn)。它由238個(gè)氨基酸殘基組成，序列中的65-67位殘基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自發(fā)形成熒光發(fā)色基團(tuán)——對(duì)羥基苯咪唑啉酮。GFP的化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，無光漂白現(xiàn)象，用甲醛固定和石蠟包埋亦不影響其熒光性質(zhì)。在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色熒光蛋白基因常被用作報(bào)告基因【2-4】。目前GFP的應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)部分： （1）作為分子標(biāo)記：GFP作為一種新型，高效的報(bào)告基因，已經(jīng)在生物研究中得到了廣泛的應(yīng)用，利用綠色熒光蛋白獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染適合的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后利用熒光顯微鏡便可以對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)致，仔細(xì)的觀察研究。Casper【5】將gfpcDNA插入到的TMr基因組cDNA克隆中，導(dǎo)入煙草植株，在植株的局部組織（感染的葉子）和系統(tǒng)組織（整個(gè)植株）中，都觀察到了病毒的感染和GFP基因的表達(dá)。 （2）篩選新的藥物：由于GFP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)以及細(xì)胞的功能影響很小，而且它有很多種顏色不同的變種，可以同時(shí)使用不同顏色的GFP衍生物標(biāo)記相關(guān)的蛋白質(zhì)，來觀察單細(xì)胞內(nèi)相互作用的靶蛋白，再利用熒光激活細(xì)胞分離器等分理處目的細(xì)胞，從而大大擴(kuò)大了篩選新藥物的規(guī)模。章濤等【6】成功建立重組質(zhì)粒phPPAKα一IRES2一EGFP高效體外轉(zhuǎn)染表達(dá)體系，為hPPAKd受體功能的研究及基于hPPARd為靶標(biāo)的藥物篩選平臺(tái)的建立奠定了基礎(chǔ)。 （3）在基因治療中的應(yīng)用：將GFP放入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中作為標(biāo)記，使其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可直接經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行快速分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞，效果比一般的傳統(tǒng)方法要又有效得多。楊簡(jiǎn)等【7】成功地將Lenti-GFP轉(zhuǎn)染至球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈，并能維持目的基因穩(wěn)定長(zhǎng)期的表達(dá)。Lenti-GFP是血管再狹窄基因治療的理想載體。 （4） GFP基因作為免疫標(biāo)記物：利用GFP的發(fā)光特性使免疫反應(yīng)呈綠色熒光從而可以直接觀察,可望取代傳統(tǒng)的標(biāo)記技術(shù),建立特異、靈敏、簡(jiǎn)便和快速的免疫診斷新方法。岳莉莉【8】等成功地實(shí)現(xiàn)了gfp與HBVe抗原基因融合后在大腸桿菌和昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá),得到既能發(fā)射熒光又具有抗原性的雙功能融合蛋白,為獲得一種新型發(fā)光免疫診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。 （5）用GFP來構(gòu)建重組質(zhì)粒：由于GFP分子量較小,僅為27~30kD,編碼GFP的基因序列也很短,為2.6kb,所以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒,而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率【9】。 1.2質(zhì)粒篩選的一般方法 在近幾年的基因工程技術(shù)研究過程中，常用的重組質(zhì)粒細(xì)菌和空質(zhì)粒細(xì)菌的篩選方法有藍(lán)白斑篩選法、質(zhì)粒快檢法、菌落PCR、菌落原位雜交、插入失活、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)等等。常見報(bào)告/ 標(biāo)記基因有β_半乳糖苷酶基因( lacZ ) 、熒光素酶基因( lux ) 、β_葡萄糖苷酶基因( GUSA) 、CAT 和幾種常用抗菌素基因?；蚬こ碳夹g(shù)操作中最經(jīng)典的質(zhì)粒篩選方法是利用標(biāo)記基因lacZ進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，這是一種酶促催化反應(yīng)，需要加入外源底物和誘導(dǎo)物(如IPTG,X-gal)，這種方法能夠有效地起到篩選重組體的作用，但是也存在一些缺點(diǎn)，比如操作繁瑣、外源底物和誘導(dǎo)物價(jià)格昂貴、使用范圍窄、假陽性率高等。 1.3本研究的意義 GFP分子質(zhì)量小，能夠在異源細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，并發(fā)射熒光，不需要任何輔助因子參加，對(duì)細(xì)胞沒有毒性，這些特點(diǎn)都使之非常適合構(gòu)建基因工程載體。與lacZ相比，GFP分子很小，僅為27KD，它主要以單體形式發(fā)揮功能；而lacZ就大得多，達(dá)135KD，并且以四聚體形式發(fā)揮功能。因此，GFP作為報(bào)告基因從本質(zhì)上更適合用作融合蛋白。 結(jié)合GFP獨(dú)特的優(yōu)良性質(zhì)和目前重組質(zhì)粒篩選的現(xiàn)狀，我們研究了利用綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，構(gòu)建一種新型的質(zhì)粒載體，不需要外源底物和誘導(dǎo)物，從而替代藍(lán)白斑篩選，建立以綠白斑篩選方法篩選陽性重組子的新方法，更簡(jiǎn)單、高效、快捷、可靠。 這種融合了綠色熒光蛋白基因的新型質(zhì)粒載體的構(gòu)建，不僅可以拓展綠色熒光蛋白的應(yīng)用范圍，而且為篩選細(xì)菌重組質(zhì)?？寺√峁┬碌募夹g(shù)方案。 2 材料與方法 2.1材料 2.1.1 菌株 E.coli DH5α 2.1.2 試劑 PCR試劑盒，DNA純化回收試劑盒，質(zhì)粒純化回收試劑盒，DNA Marker、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；EcoRⅠ，NdeⅠ，T4 DNA聚合酶， PET-28a-GFP由浙江省生命科學(xué)學(xué)科競(jìng)賽主委會(huì)提供，其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。 2.1.3 主要儀器 PCR儀（德國(guó)Eppendorf），離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），凝膠成像系統(tǒng) 2.2方法 2.2.1 GFP基因的克隆 2.2.1.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)綠色熒光蛋白基因序列設(shè)計(jì)了以下引物： 綠色熒光蛋白基因上游引物： 5-GTGAATTCTATGGTGAGCAAGGGCG-3（劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)） 綠色熒光蛋白基因下游引物： 5-CGGCATATGTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3（劃線部分為Nde I酶切位點(diǎn)） 2.2.1.2 GFP基因擴(kuò)增 在PCR管中分別加入 試劑 體積/μL PET-28a 1 10× PCR buffer 5 dNTPmix 4 Taq酶 0.25 GFP上游引物 0.5 GFP下游引物 0.5 ddH2O 38.75 總體積 50 反應(yīng)程序： 94℃條件下使模板DNA變性5min。 變性 94℃ 30s 退火 55℃ 30s 延伸 72℃ 1min 最后在72℃條件下延伸10分鐘。 反應(yīng)完畢后各取3-5 μL 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 2.2.1.3 PCR產(chǎn)物的純化 用TAKARA公司的DNA試劑盒來提取純化GFP基因 (1)使用TAE緩沖液或TBE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對(duì)目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 (2)在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸凈凝膠表面的液體。 (3)切碎膠塊。 (4)稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí)，以1mg=1ul進(jìn)行計(jì)算。 (5)向膠塊中加入膠塊融化液DR-ⅠBuffer，DR-ⅡBuffer的量如下表： 凝膠濃度 DR-ⅠBuffer體積 1.0% 3個(gè)凝膠體積量 1.0%~1.5% 4個(gè)凝膠體積量 1.5%~2.0% 5個(gè)凝膠體積量 (6)均勻混合后75℃加熱融化膠塊。 (7)向上述膠塊融化液中加入DR-ⅠBuffer量的1/2體積量的DR-ⅡBuffe，均勻混合。 (8)將試劑盒中的Spin Column 安置于Collection Tube上。 (9)將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rmp離心1分鐘，棄濾液。 (10)將500ul的Rinse A 加入Spin Column中，12000rmp離心半分鐘，棄濾液。 (11)將700ul的Rinse B 加入Spin Column中，12000rmp離心半分鐘，棄濾液。 (12)重復(fù)操作步驟11。 (13)將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25ul的滅菌蒸餾水或Elution Buffer,室溫靜置1分鐘。（60℃的滅菌蒸餾水或Elution Buffer有利于提高洗脫效率。） (14)12000rpm離心1分鐘洗脫DNA。 2.2.2 構(gòu)建融合GFP基因的重組質(zhì)粒pGreenYU 2.2.2.1 GFP基因的雙酶切 在無菌的微量離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)成分： 試劑 體積/ ul GFP基因 30 EcoRⅠ 1 NdeⅠ 1 Buffer H 4 ddH2O 4 總體積 40 反應(yīng)體系在恒溫水浴鍋里37℃酶切4小時(shí)。產(chǎn)物在-20℃保存。 2.2.2.2對(duì)GFP基因雙酶切體系進(jìn)行純化 參照2.2.1.3 PCR產(chǎn)物的純化 2.2.2.3對(duì)PUC19質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切 在無菌的微量離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)成分： 試劑 體積/ ul PUC19質(zhì)粒 30 EcoRⅠ 1 NdeⅠ 1 Buffer H 4 ddH2O 4 總體積 40 2.2.2.4對(duì)PUC19質(zhì)粒雙酶切體系進(jìn)行純化 參照2.2.1.3 PCR產(chǎn)物的純化 2.2.2.5將GFP基因雙酶切產(chǎn)物連接到PUC19質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物中 在無菌的微量離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)成分 試劑 體積/ ul GFP基因雙酶切產(chǎn)物 6 PUC19質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物 2 T4 DNA連接酶 1 10×Buffer 1 總體積 10 先將GFP基因片段和PUC19質(zhì)粒載體片段在45℃中溫浴5分鐘，再在冰浴中冰浴10分鐘，然后先把Buffer加入體系中，再加T4 DNA連接酶，最后放到16℃的恒溫水浴鍋中連接24小時(shí)。 2.2.2.6感受態(tài)細(xì)胞的制備 （1）將DH5a活化24小時(shí)。 （2）取三角瓶中的菌液40ul,接種到含有4ml LB培養(yǎng)基的試管中搖6小時(shí)。 （3）將試管放置在冰浴中30min。取1.5ml菌液裝到1.5ml離心管中，3000rmp離心5min,棄上清,用1000μL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮沉淀。冰浴30min （4）4000rmp離心5min,棄上清,用200μL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮沉淀。冰浴10min。 2.2.2.7將連接產(chǎn)物導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞 （1）感受態(tài)細(xì)胞200ul +8ul連接產(chǎn)物 （2）冰浴30min （3）42℃溫浴90S。 （4）立刻冰浴5min。 （5）加800ul新鮮LB培養(yǎng)基。 （6）放置到搖床搖1小時(shí) （7）3000rmp離心5min,吸取700ul上清培養(yǎng)基。 （8）打勻菌體，吸取菌體涂在含有氨芐青霉素的平板上。 （9）溫箱培養(yǎng) 2.2.2.8提取質(zhì)粒 堿裂解法小量制備重組質(zhì)粒pGreenYU （1）取1.5 mL過夜培養(yǎng)的菌液，室溫，6000rpm離心5min，棄去上清，倒置于吸水紙上，使培養(yǎng)液流盡； （2）加入100μL冰預(yù)冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，調(diào)pH至8.0），振蕩混勻，冰浴5min； （3）加入200μL溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH，1%SDS），溫和顛倒數(shù)次，混勻，冰浴5min； （4）加150μL溶液Ⅲ（5mol/L 醋酸鉀60mL，冰醋酸11.5mL，ddH2O 28.5mL），上下顛倒混勻，冰浴5 min； （5）12000rpm，4℃離心10 min，將水相轉(zhuǎn)至干凈的1.5mL eppendorf管； （6）加入等體積酚/氯仿，上下顛倒混勻，12000rpm，離心5 min； （7）將上清移至另一1.5mL eppendorf管中，加入2倍體積乙醇（-20℃預(yù)冷），混勻，室溫放置5min后，12000rpm，4℃離心10 min； （8）棄上清，沉淀加1mL 70%乙醇漂洗，12000rpm，4℃，離心5 min；棄上清，沉淀于室溫或37℃干燥20-30min，加30μL左右的溶有RNA酶（20μg/mL）的ddH2O，溶解DNA，短暫振蕩或用加樣器上下吹打混勻，37℃作用30min； 取3-5μL進(jìn)行1%瓊脂糖電泳。 2.2.3對(duì)融合有GFP基因的重組質(zhì)粒pGreenYU進(jìn)行鑒定 2.2.3.1對(duì)重組質(zhì)粒pGreenYU進(jìn)行雙酶切鑒定 在無菌的微量離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)成分 試劑 體積/ ul 重組質(zhì)粒pGreenYU 30 EcoRⅠ 1 NdeⅠ 1 Buffer H 4 ddH2O 4 總體積 40 2.2.3.2對(duì)重組質(zhì)粒pGreenYU進(jìn)行PCR鑒定 在無菌的微量離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)成分 試劑 體積/μL 重組質(zhì)粒pGreenYU 1 10× PCR buffer 5 dNTPmix 4 Taq酶 0.25 GFP上游引物 0.5 GFP下游引物 0.5 ddH2O 38.75 總體積 50 反應(yīng)程序： 94℃條件下使模板DNA變性5min。 變性 94℃ 30s 退火 55℃ 30s 延伸 72℃ 1min 最后在72℃條件下延伸10分鐘。 反應(yīng)完畢后各取3-5 μL 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 2.2.3.3對(duì)含有重組質(zhì)粒pGreenYU的E.coli DH5α進(jìn)行菌種保藏 （1）用火焰滅菌的接種環(huán)取斜面菌種在平皿上劃線分離單菌落。 （2）平皿倒置于30℃或37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24-48小時(shí)，至單菌落的大小為3mm左右。 （3）挑取一個(gè)單菌落，接種于一個(gè)裝50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振蕩培養(yǎng)10-15小時(shí)，至菌密度OD600為1.0-1.5。 （4）用火焰滅菌的接種環(huán)取少量種子液，涂片后，作革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)，及是否有雜菌。 （5）按30%甘油：種子液為1：1（V/V）的量加入無菌甘油， 混合后分裝至事先滅菌的菌種保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。 3 結(jié)果與分析 3.1 GFP基因的克隆 以pet-28a-GFP質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在Marker 750bp附近有一條特異性條帶，大小與GFP基因大小的理論值714相符。（如圖1） 圖1 綠色熒光蛋白基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 M：DNA Marker 1：綠色熒光蛋白基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 3.2 PUC19質(zhì)粒酶切 用EcoR I酶和Nde I酶將puc19質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將puc19質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)下游EcoR I酶切位點(diǎn)和Nde I酶切位點(diǎn)的LacZ基因片段切下，從圖2中我們可以發(fā)現(xiàn)成功切下了大約250bp左右的基因片段，這與EcoR I酶切位點(diǎn)和Nde I酶切位點(diǎn)之間的核苷酸片段的大小212bp相符。 圖2 PUC19質(zhì)粒的雙酶切（EcoR I酶和Nde I酶） M：DNA Marker 1：puc19質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物 3.3重組質(zhì)粒pGreenYU轉(zhuǎn)化后平板培養(yǎng)和菌液離心后的結(jié)果 圖3 左：轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pGreenYU的大腸桿菌平板；右：菌液離心后的菌體沉淀 圖3中左圖為轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pGreenYU大腸桿菌涂平板培養(yǎng)24小時(shí)后，在紫外光下可見菌落激發(fā)出較強(qiáng)熒光。圖3中右圖為收集轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒大腸桿菌菌液至離心管中，3500rpm離心5分鐘后，在紫外燈下可見沉淀菌體激發(fā)出的較強(qiáng)綠色熒光。圖3說明GFP基因片段已經(jīng)在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá), 重組質(zhì)粒pGreenYU的構(gòu)建初步成功。 3.4重組質(zhì)粒pGreenYU的雙酶切和PCR擴(kuò)增鑒定 圖4重組質(zhì)粒的EcoR I和Nde I雙酶切電泳圖 1：報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pGreenYU的雙酶切條帶； M：Marker 圖5重組質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增GFP基因電泳圖 1：擴(kuò)增出來的GFP基因條帶； M：Marker 圖4中重組質(zhì)粒在EcoR I和Nde I雙酶切后，電泳跑出一條750bp左右的條帶，長(zhǎng)度與GFP基因理論值相符，表明從重組質(zhì)粒pGreenYU中切出GFP基因片段。 圖5中以重組質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增GFP基因，也擴(kuò)增出跑長(zhǎng)度750bp左右的條帶，表明重組質(zhì)粒pGreenYU中含有GFP基因。 這兩張電泳圖可以充份證明重組質(zhì)粒pGreenYU中連入了GFP基因，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功！ 4 討論 4.1 重組質(zhì)粒pGreenYU的優(yōu)點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)PUC19質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將PUC19質(zhì)粒上的LacZ基因片段用GFP基因片段替代，連接到該質(zhì)粒上，從而在PUC19質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上形成以綠色熒光蛋白序列為報(bào)告基因的新型質(zhì)粒。他的表達(dá)產(chǎn)物無需任何底物和輔助因子，節(jié)省了傳統(tǒng)方法所需的X-gal和IPTG,并且這一GFP突變體的激發(fā)波長(zhǎng)移至可見光區(qū)，在日光下也可以用肉眼觀察到綠色熒光。在紫外光下熒光更加強(qiáng)烈，不失為一種靈敏經(jīng)濟(jì)的質(zhì)粒載體。其優(yōu)點(diǎn)主要包括以下幾點(diǎn) （1）操作簡(jiǎn)單，結(jié)果一目了然。識(shí)鑒于綠色熒光蛋白的自發(fā)熒光特性，發(fā)光不需要其他的協(xié)助因子，因而可以把轉(zhuǎn)化后的平板直接通過紫外照射，發(fā)出綠色熒光的菌體為空質(zhì)粒菌體，而無綠色熒光的菌體為含有重組質(zhì)粒的菌體。 （2）GFP的熒光反應(yīng)不需要底物和輔助因子。只需要一定波長(zhǎng)的紫外光照射就能發(fā)出明亮的熒光，肉眼也可以清晰地看到。 （3）GFP的熒光性質(zhì)穩(wěn)定。它的熒光衰減現(xiàn)象弱，抗酸堿能力強(qiáng)，適用溫度范圍大【10】。 （4）生理影響小。它與目的基因融合以后，不會(huì)對(duì)目的基因產(chǎn)生影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍然可以連續(xù)傳代。 （5）構(gòu)建載體比較方便。由于編碼GFP的基因序列比較短，很適合構(gòu)建質(zhì)粒載體而且對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效果影響很小【11】。 此克隆載體與近期發(fā)表的綠色熒光蛋白載體相比有一定的差異性和優(yōu)越性。比如利用GFPS65T構(gòu)建的克隆載體的多克隆位點(diǎn)比較少，只有6個(gè)，并且在日光下重組菌斑和空載菌斑的區(qū)分度不大【12-14】。而克隆載體pGreenLD也有不同程度的減少了幾個(gè)酶切位點(diǎn)Not I、Sac I等【15】。相比之下本實(shí)驗(yàn)的新型熒光克隆載體pGreenYU在不減少多克隆位點(diǎn)的情況下保持了前幾種熒光載體的優(yōu)點(diǎn)。因此我們相信，新型綠色熒光載體的前景比較廣闊，實(shí)用價(jià)值相對(duì)比較高。 4.2 重組質(zhì)粒pGreenYU的缺點(diǎn) 本研究可以應(yīng)用于重組質(zhì)粒篩選，但是GFP表達(dá)后要調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度比較困難，不能像熒光素那樣通過增加底物來擴(kuò)大熒光效果，這一點(diǎn)需要進(jìn)一步改進(jìn)。 對(duì)于重組載體pGreenYU對(duì)目的基因的使用范圍有一定的局限性。對(duì)于需要通過重組puc19來克隆的目的基因序列中必須要有終止密碼子。 4.3 熒光法和藍(lán)白斑法的篩選效率 PUC19載體攜帶lacZ’基因，它編碼β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且處于可被安慰誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，與乳糖結(jié)構(gòu)類似但不能被β-半乳糖苷酶降解）誘導(dǎo)的啟動(dòng)子調(diào)控之下。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌為L(zhǎng)acZ△M15 基因型（含有編碼N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后，在IPTG 的誘導(dǎo)下，質(zhì)粒與基因組分別表達(dá)缺陷但可以相互補(bǔ)償?shù)膬蓚€(gè)肽（即α-互補(bǔ)），形成了有功能的β-半乳糖苷酶，該酶能把培養(yǎng)基中無色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深藍(lán)色的5-溴-4-氯-靛藍(lán)。然而當(dāng)外源DNA 插入質(zhì)粒位于α-肽編碼序列中的多克隆位點(diǎn)時(shí)，由于破壞了α-肽的閱讀框架，因而不能表達(dá)出與宿主菌基因組表達(dá)的缺陷型β-半乳糖苷酶多肽發(fā)生α-互補(bǔ)。當(dāng)用綠色熒光蛋白基因替代lacZ’基因后，沒有在多克隆位點(diǎn)插入外源基因的PUC19載體可以表達(dá)有功能的綠色熒光蛋白，從而顯示出綠色熒光，當(dāng)多克隆位點(diǎn)插入外源基因時(shí)，破壞了綠色熒光蛋白基因的閱讀框，從而不表現(xiàn)出綠色熒光，達(dá)到通過熒光篩選重組質(zhì)粒的目的。此種方法不需要加額外的底物，只需紫外燈即可達(dá)到目的。 4.4 研究展望 本研究對(duì)PUC19質(zhì)粒進(jìn)行的改造，獲得了以綠色熒光蛋白GFP基因?yàn)閳?bào)告基因的新型質(zhì)粒載體，可作為今后重組質(zhì)粒篩選的新工具，有望簡(jiǎn)化重組質(zhì)粒篩選過程、節(jié)約試劑成本、提升篩選效果。并且擴(kuò)大了PUC19質(zhì)粒和綠色熒光蛋白GFP的應(yīng)用范圍，同時(shí)為重組質(zhì)粒篩選提供了一種有效的技術(shù)方案，為生命科學(xué)的研究起到一定的促進(jìn)作用。但其篩選效果與傳統(tǒng)藍(lán)白斑相比孰優(yōu)孰劣，有待將測(cè)試基因?qū)牒髾z驗(yàn)其效果。 目前為止．大約有幾十種不同特性的熒光蛋白可供選擇使用，這些蛋白質(zhì)的熒光光譜幾乎覆蓋了整個(gè)可見區(qū)。一個(gè)好的熒光蛋向需具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：抗酸、抗漂白、亮度高、成熟快及單體結(jié)構(gòu)。隨著對(duì)GFP的基礎(chǔ)理論研究的深入。新一代GFP衍生物熒光信號(hào)和蛋白的可溶性等的明顯提高，成像技術(shù)和顯微鏡的改進(jìn)，新型計(jì)算機(jī)及應(yīng)用程序的出現(xiàn)．相信這些問題終將得到解決。與此同時(shí)，隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)的日益成熟，GFP一定會(huì)帶來更多的應(yīng)用價(jià)值．并進(jìn)一步揭開生命的未解之謎【16】。 本研究還可以通過不同種類的熒光蛋白構(gòu)建新的載體，從而來滿足生命科學(xué)的研究需要，比如可以通過構(gòu)建含有不同顏色的熒光蛋白載體來更好的區(qū)分我們所要的重組體菌斑。把多彩的顏色帶到生物的研究當(dāng)中。 參考文獻(xiàn) 【1】Shimomura O.Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protrin[J].FEBS Letters,1979,104:220-222. 【2】 Grebenok R J, Pierson E, Lambert G M, Gong F_C, Claudio L A, Ruth H C, Janes C C, David 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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：利用GFP作為報(bào)告基因，構(gòu)建一種新型的質(zhì)粒載體，可以通過激發(fā)光照射后有無熒光產(chǎn)生進(jìn)行高效的重組質(zhì)粒篩選，建立了一種快捷可靠、低假陽假陰性、高通量的細(xì)菌重組質(zhì)粒篩選方法。這種融合GFP基因的新型質(zhì)粒載體構(gòu)建為篩選細(xì)菌重組質(zhì)?？寺√峁┬碌募夹g(shù)方案?；舅悸罚和ㄟ^引物設(shè)計(jì)對(duì)GFP基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后構(gòu)建含有GFP基因的PUC19質(zhì)粒，再通過測(cè)試基因插入到重組質(zhì)粒中進(jìn)行檢測(cè)效果。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 在近幾年的基因工程技術(shù)研究過程中，常用的重組質(zhì)?？寺『涂召|(zhì)粒細(xì)菌的篩選方法有最經(jīng)典的利用a互補(bǔ)原理的藍(lán)白斑篩選，還有質(zhì)?？鞕z法、菌落PCR、菌落原位雜交、插入失活、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)等等。這些方法或多或少都存在操作繁瑣、耗費(fèi)資金、使用范圍很窄、假陽性率高等缺點(diǎn)。因此我們需要研究一種新型的質(zhì)粒載體 ，可以更簡(jiǎn)單高效、快捷可靠的篩選細(xì)菌重組質(zhì)?？寺 ?/dd>
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本研究目的在于利用綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，構(gòu)建一種新型的質(zhì)粒載體，可以通過激發(fā)光照射有無熒光產(chǎn)生進(jìn)行高效的重組質(zhì)粒篩選，建立了一種快捷可靠、低假陽假陰性、高通量的細(xì)菌重組質(zhì)粒篩選方法。這種融合熒光蛋白基因的新型質(zhì)粒載體構(gòu)建，不僅可以拓展綠色熒光蛋白的應(yīng)用范圍，而且為篩選細(xì)菌重組質(zhì)?？寺√峁┬碌募夹g(shù)方案。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本研究主要內(nèi)容是構(gòu)建一種以綠色熒光蛋白（GFP）為報(bào)告基因的新型載體。實(shí)驗(yàn)用EcoRⅠ、NdeⅠ兩種酶對(duì)PUC19質(zhì)粒和GFP基因進(jìn)行雙酶切，將PUC19質(zhì)粒上的原報(bào)告基因LacZ片段切下后連入GFP基因，形成以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因的新型質(zhì)粒載體pGreenYU。新載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α，搖菌后發(fā)現(xiàn)菌液呈現(xiàn)出明顯的熒光。提取菌液中的質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切及PCR鑒定，結(jié)果證明，新型熒光載體pGreenYU構(gòu)建成功。
獲獎(jiǎng)情況
- 在浙江省生命科學(xué)學(xué)科競(jìng)賽中獲得優(yōu)勝獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 新型熒光載體pGreenYU構(gòu)建成功
參考文獻(xiàn)
- 藍(lán)白斑篩選 質(zhì)?？鞕z法 菌落PCR 菌落原位雜交 插入失活 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
同類課題研究水平概述
- 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)GFP是能在活細(xì)胞中表達(dá)的發(fā)光蛋白；作為熒光標(biāo)記分子，GFP既具有敏感的標(biāo)記檢測(cè)率，又沒有放射性的危害一個(gè)良好的細(xì)胞間信跟蹤觀測(cè)第二信使。 李壽東等構(gòu)建了以gfpS65T基因作為篩選標(biāo)記的新型克隆載體,建立了以綠/白斑篩選法篩選陽性重組子的新方法,替代LacZ藍(lán)/白斑篩選,不需X-gal,經(jīng)濟(jì),簡(jiǎn)單可行. Leff等用GFP標(biāo)記遺傳工程微生物以監(jiān)測(cè)其在水環(huán)境中的存活和去向. 朱應(yīng)等構(gòu)建了帶gfp基因的重組棉鈴蟲病毒.該病毒一次感染棉鈴蟲后不再重復(fù)感染,室內(nèi)飼養(yǎng)3代，各代均可見典型的發(fā)綠色熒光的棉鈴蟲,表明病毒可以介導(dǎo)GFP標(biāo)記其宿主,預(yù)計(jì)將為研究棉鈴蟲的遷飛和暴發(fā)規(guī)律提供強(qiáng)有力的手段. Sampali Banerjee Jitendra Kumar Anjali Apte-Deshpande Sriram Padmanabhan 五個(gè)人成功構(gòu)建一種可以直接在大腸桿菌里研究直接表達(dá)的含有GFP的融合原核載體 Yuk等使用GFP作為標(biāo)記能快速篩選出生長(zhǎng)抑制環(huán)境下，仍能保持重組蛋白大量表達(dá)的CHO細(xì)胞。 目前，GFP已經(jīng)被成功地用于靶向標(biāo)記包括細(xì)胞核，線粒體，質(zhì)體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等在內(nèi)的細(xì)胞器。用GFP進(jìn)行亞細(xì)胞定位，避免了提純蛋白，標(biāo)記異硫氰酸熒光素等熒光染料，經(jīng)顯微注射或其他方式導(dǎo)入細(xì)胞的復(fù)雜方法，從而使研究蛋白在活細(xì)胞的準(zhǔn)確定位變得簡(jiǎn)單易行。
