基本信息
- 項目名稱：
- 板栗疫病菌Rab蛋白Ypt7的定位和功能研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本研究構(gòu)建pcpxHY2-ypt7-GFP載體，利用綠色熒光蛋白對板栗疫病菌Rab蛋白Ypt7進行定位，發(fā)現(xiàn)Ypt7定位于液泡內(nèi)。利用高效基因打靶系統(tǒng)Δcpku80敲除板栗疫病菌ypt7基因，獲得基因缺失突變體，通過觀察基因缺失株與正常菌株之間的性狀變化，明確該基因的功能，在板栗疫病菌的致病力上有新的突破。
- 詳細介紹：
- Rab族蛋白是小G蛋白Ras家族最大的亞家族之一。研究表明它主要參與細胞內(nèi)的囊泡運輸，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)各種蛋白在細胞內(nèi)外的正確運輸和分配。我們在進行板栗疫病菌基因組序列分析時，發(fā)現(xiàn)一個與酵母菌Rap基因ypt7有高度同源性的基因, 并將其命名為cpypt7。研究發(fā)現(xiàn)ypt7基因與致病性和自噬相關(guān)。本研究克隆了cpypt7，利用綠色熒光蛋白對該基因編碼的蛋白進行了準確定位，并采用基因敲除的方法對其功能進行了初步研究。構(gòu)建pcpxHY2-ypt7-GFP載體，在熒光顯微鏡下觀察到Y(jié)pt7蛋白定位于菌絲體的液泡。以△cpku80突變體作為出發(fā)菌株，通過同源雙交換獲得了3株cpypt7基因缺失突變體。觀察基因缺失株與野生菌株之間的性狀差異，發(fā)現(xiàn)缺失菌株菌落邊緣呈鋸齒狀分化，菌落色素、致病力和分生孢子量都顯著下降。該結(jié)果初步表明cpypt7基因的正常表達會影響到板栗疫病菌的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量、致病力。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 研究目的：對板栗疫病菌Rab蛋白Ypt7進行定位并對該蛋白進行功能研究，明確cpypt7基因與板栗疫病菌的致病力的關(guān)系。 基本思路：本實驗采用綠色熒光蛋白基因作為標記基因?qū)pt7的位置進行定位，并通過基因敲除的方法將cpypt7基因敲除，獲得cpypt7基因的缺失菌株，對基因缺失株和野生株之間的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量及致病力的差異，明確基因的功能。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 科學(xué)性：本研究克隆了cpypt7，將其與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染細胞進行表達，可對Ypt7進行觀察。并采用基因敲除對該基因的功能進行研究。先進性：本研究首次在板栗疫病菌中研究與Rab蛋白Ypt7的定位和功能。研究過程中應(yīng)用的方法對其它病原真菌的研究起到借鑒作用。獨特之處：本研究發(fā)現(xiàn)Rab蛋白Ypt7定位于在板栗疫病菌的液泡，cpypt7的表達會影響到板栗疫病菌的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量、致病力。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 本作品加深了對板栗疫病菌Rab的認蛋白的認識，研究過程中應(yīng)用的方法對其它病原真菌的研究起到借鑒作用，為將來改進真菌病害防治方法提供了新知識。
學(xué)術(shù)論文摘要
- Rab族蛋白是小G蛋白Ras家族最大的亞家族之一。研究表明它主要參與細胞內(nèi)的囊泡運輸，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)各種蛋白在細胞內(nèi)外的正確運輸和分配。我們在進行板栗疫病菌基因組序列分析時，發(fā)現(xiàn)一個與酵母菌Rap基因ypt7有高度同源性的基因, 并將其命名為cpypt7。研究發(fā)現(xiàn)ypt7基因與致病性相關(guān)。本研究克隆了cpypt7，利用綠色熒光蛋白對該基因編碼的蛋白進行了準確定位，并采用基因敲除的方法對其功能進行了初步研究。構(gòu)建pcpxHY2-ypt7-GFP載體，在熒光顯微鏡下觀察到Y(jié)pt7蛋白定位于菌絲體的液泡。以△cpku80突變體作為出發(fā)菌株，通過同源雙交換獲得了3株cpypt7基因缺失突變體。觀察基因缺失株與野生菌株之間的性狀差異，發(fā)現(xiàn)缺失菌株菌落邊緣呈鋸齒狀分化，菌落色素、致病力和分生孢子量都顯著下降。該結(jié)果初步表明cpypt7基因的正常表達會影響到板栗疫病菌的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量、致病力。
獲獎情況
- 無。
鑒定結(jié)果
- 無。
參考文獻
- [1] Hebard F V, Griffin G J, Elkins J R. Developmental Histopathology of Cankers Incited by Hypovirulent and Virulent Isolates of Endothia-Parasitica on Susceptible and Resistant Chestnut Trees. Phytopathology, 1984, 74(2): p.140-149. [2] Merkel HW. A deadly fungus on the American chestnut, New York Zoological Society. 10th Annual Report ,1905, 5:97-103. [3] Hill man BI, Elkins R. Developmental histopathology of cankers incited by hypovirulent and virulent isolates of Endothia parasitica on susceptible and resistant chestnut tress. Phytopathology ,1984, 74:140-149 [4]Griffin GJ. Chestnut blight and its control. Hort Rev, 1986, 8:293-335 [5]Nuss D.L. 1992. Biological od chestnut blight: an example of virusmediated attenuation of fungal pathogenesis. 56:561-576. [6]Guledner U, Heck S, Pleder T, et al. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Ren, 1996, 24(13): p. 2519-2524.
同類課題研究水平概述
- 真核生物內(nèi)膜系統(tǒng)各細胞器之間存在著脂類和蛋白之間的運輸，這是通過復(fù)雜的囊泡運輸和微管系統(tǒng)來完成的。Rab小G蛋白作為膜相關(guān)的分子開關(guān)，是囊泡形成、轉(zhuǎn)移和融合過程中的核心調(diào)節(jié)因子，在囊泡的形成、轉(zhuǎn)運、粘附、錨定、融合等過程中起作用。最新的人類基因組測序結(jié)果表明，人類至少有70個Rab蛋白[7]廣泛存在于各染色體。就某個Rab而言，在哺乳動物和酵母中功能是保守的。板栗疫病是一種世界范圍內(nèi)的重要林木病害，引起板栗疫病的病原菌是板栗疫病菌，具備高度的遺傳穩(wěn)定性、有優(yōu)良的遺傳操作系統(tǒng)和全面的分子遺傳學(xué)信息，廣泛應(yīng)用于植物以及病害的生物防治。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein)，簡稱GFP，這種蛋白質(zhì)最早是由下村修等人在1962年在一種學(xué)名Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)。利用綠色熒光蛋白獨特的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標簽，即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因融合表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質(zhì)進行細胞內(nèi)活體觀察。目前對板栗疫病菌基因功能的研究方法有RNA干擾和基于同源重組的基因敲除方法。研究中發(fā)現(xiàn)Δcpku80缺失菌株菌株中基因打靶效率均達到80%左右，但在野生型菌株EP155中僅為2-5%。板栗疫病菌高效基因打靶系統(tǒng)cpku80基因缺失突變體Δcpku80的成功構(gòu)建，為在板栗疫病菌中進行大規(guī)模基因功能研究提供了強有力的工具。板栗疫病菌作為植物病原菌的研究模式，研究過程中應(yīng)用的方法對其它病原真菌的研究起到借鑒作用。
