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基本信息
- 項目名稱：
- 構(gòu)建以多重抗藥性蛋白為載體的銅(II)生物熒光傳感器
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本課題選取了一種在大腸桿菌中十分重要的多重抗藥性蛋白作為目標(biāo)傳感器的載體，結(jié)合一種高效的非天然氨基酸技術(shù)，在蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)引入一活性基團(tuán)與熒光探針相連，使得銅的濃度信號轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號。 作為一個能夠響應(yīng)銅(II)的生物大分子器件，除了在理論上能給蛋白質(zhì)-金屬相互作用帶來更為深入的了解之外，實踐應(yīng)用前景也較為廣闊，對于銅的細(xì)胞毒性、銅誘發(fā)的人類疾病等方面的研究有重大意義。
- 詳細(xì)介紹：
- 為了解決現(xiàn)有活體銅(II)成像工具缺失的狀況，使一些銅相關(guān)的疾病的研究能夠深入展開，本課題設(shè)計構(gòu)建了一種銅(II)熒光生物傳感器。主要的設(shè)計結(jié)合了非天然氨基酸、溶劑化顯色熒光染料和點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)三種前沿技術(shù)。 傳感器利用MarR在銅(II)的誘導(dǎo)下會產(chǎn)生巨大的結(jié)構(gòu)變化，從而使一些位點(diǎn)的氨基酸殘基周圍環(huán)境發(fā)生由富水到疏水，最終導(dǎo)致這些殘基上的熒光小分子開啟，產(chǎn)生熒光變化。 此傳感器具有良好的檢測下限，熒光變化達(dá)到一般熒光探針的要求。相信在完成后續(xù)體內(nèi)實驗后，我們能夠?qū)⑦@項技術(shù)真正地推廣到分子醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，為人類疾病的深入研究作出貢獻(xiàn)。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 為了解決現(xiàn)有活體銅(II)成像工具缺失的狀況，并且使一些銅相關(guān)的疾病的研究能夠深入展開，我們設(shè)計了一種基于大腸桿菌多重抗藥性蛋白(MarR)的銅(II)生物熒光傳感器。 傳感器的基本設(shè)計思路是利用MarR在銅(II)存在情況下產(chǎn)生的巨大構(gòu)象變化，讓一種固定在MarR特定部位的熒光小分子來響應(yīng)這個構(gòu)象變化，從而給出熒光信號。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 傳感器的設(shè)計是建立在經(jīng)典的蛋白質(zhì)工程上，利用MarR兩種狀態(tài)下不同的構(gòu)象進(jìn)行設(shè)計。這些設(shè)計有許多文獻(xiàn)和已解出的MarR晶體結(jié)構(gòu)為依據(jù)，是一種理性化設(shè)計而不是簡單的嘗試-錯誤(Try-Error)設(shè)計體系。其先進(jìn)性和獨(dú)特之處在于此傳感器是第一個可用于細(xì)胞內(nèi)成像的銅(II)傳感器。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 作品可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像，特別是神經(jīng)生物學(xué)的研究。比如研究在不同的神經(jīng)刺激下銅(II)分布情況的改變，來推導(dǎo)出銅(II)參與何種神經(jīng)調(diào)節(jié)過程。其也可應(yīng)用于分子醫(yī)學(xué)中，對于一些銅相關(guān)的疾病研究有著重要意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 在這項課題中，大腸桿菌中普遍存在的一種多重抗藥性蛋白(MarR)的特殊性質(zhì)被詳細(xì)研究，使用了聚丙烯酰胺凝膠電泳、快速蛋白質(zhì)液相層析系統(tǒng)和ANS熒光滴定等實驗技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)其能對銅(II)信號產(chǎn)生特異性的響應(yīng)。 在此事實基礎(chǔ)之上，結(jié)合非天然氨基酸(Unnatural Amino Acid)、溶劑化顯色熒光染料和點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)(Click Reaction)三種前沿技術(shù)，我們設(shè)計并且成功地開發(fā)了一種新型活體銅(II)生物傳感器。其利用MarR在銅(II)的誘導(dǎo)下會產(chǎn)生巨大的結(jié)構(gòu)變化，從而使一些位點(diǎn)的氨基酸殘基周圍環(huán)境發(fā)生由富水到疏水，最終導(dǎo)致這些殘基上的熒光小分子開啟，產(chǎn)生熒光變化。 我們對所構(gòu)建的傳感器進(jìn)行了初步的體外(in vitro)熒光性質(zhì)實驗的測試。從實驗結(jié)果來看，傳感器具有良好的檢測下限（靈敏度），同時其熒光變化達(dá)到一般熒光探針?biāo)蟮淖兓?。相信在完成后續(xù)體內(nèi)(in vivo)實驗后，我們能夠?qū)⑦@項技術(shù)真正地推廣到分子醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，為人類疾病的深入研究作出貢獻(xiàn)。
獲獎情況
- 1.在研項目，尚未公開發(fā)表，論文已遞交美國化學(xué)會審閱，將發(fā)表于美國化學(xué)會期刊(Journal of American Chemistry Society, JACS,影響因子8.2)。 2.xx大學(xué)第十九屆挑戰(zhàn)杯--特等獎 3.第六屆首都挑戰(zhàn)杯--一等獎
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- 銅生物傳感器相關(guān) 1.SC Dodani et. al, Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy, PNAS, 2011 2.SV Wegner et. al, Dynamic Copper (I) Imaging in Mammalian Cells with a Genetically Encoded Fluorescent Copper (I) Sensor, JACS, 2010 MarR(多重抗藥性蛋白)相關(guān) 3.MN Alekshun et. al,The crystal structure of MarR, a regulator of multiple antibiotic resistance, at 2.3 ? resolution, Nat Struc, 2001 非天然氨基酸技術(shù)相關(guān) 4.L Wang et. al, Expanding the genetic code of Escherichia coli, Science, 2001 點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)相關(guān) 5.HC Kolb et. al, Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions, Angew Chemie, 2001 溶劑化顯色熒光染料相關(guān) 6. GS Loving et. al, Monitoring protein interactions and dynamics with solvatochromic fluorophores, Trends in biotech, 2010
同類課題研究水平概述
- 目前，國際上對于活體銅(II)生物傳感器（特別是熒光傳感器）的競爭十分激烈，有許多實驗室都在各自開展對其開發(fā)的研究，其原因主要有以下幾點(diǎn)。 1.銅的生物學(xué)研究還十分缺乏，并沒有太多工具可以供人們使用去直接觀察銅在細(xì)胞或者組織各個部位的含量與分布，以及銅在外界刺激下的富集與釋放。 2.所有的銅傳感器中，能直接用于細(xì)胞內(nèi)成像的只有五個，最新的一個發(fā)表于2011年3月的美國科學(xué)院院刊。而其他所有傳感器由于需要工作在有機(jī)溶液的環(huán)境下，使其毫無生物相容性可言。 3.上述的幾個銅傳感器都是對于銅(I)的檢測，這是由于銅(II)在細(xì)胞中含量相對較低，并且其與鎳(II)等離子的化學(xué)性質(zhì)非常相似，難以開發(fā)出特異性高的傳感器。而能夠檢測銅(II)的生物傳感器又無法進(jìn)行細(xì)胞成像。 綜上，當(dāng)前并沒有關(guān)于銅(II)生物傳感器的同類課題研究可供參考，因此本課題具有較好的創(chuàng)新性。完成后續(xù)部分工作，成功開發(fā)完成銅(II)傳感器之后，對于相關(guān)的銅生物學(xué)研究有著非常重要的意義，例如 Alzheimer癥和阮病毒癥等一些尚未完全研究清楚，且病因十分復(fù)雜的神經(jīng)疾病。 然而從生物熒光傳感器的角度來看，這已經(jīng)是一塊研究進(jìn)展十分迅速，并且競爭逐漸激烈的熱門領(lǐng)域。自從Roger Tsein(錢永健)發(fā)現(xiàn)了GFP（綠色熒光蛋白）之后，人們開始利用這些熒光蛋白的基因編碼特性，構(gòu)建出了一系列的活體鈣(II)生物傳感器，開啟了一個鈣神經(jīng)科學(xué)的時代，對于神經(jīng)科學(xué)的研究帶來了突破性的飛躍。 本課題所使用都是一些較為成熟，前人已經(jīng)進(jìn)行大量研究并且驗證其有效性的技術(shù)，以這些技術(shù)為基礎(chǔ)，獨(dú)創(chuàng)性地將其有效地組合，從而完成我們所設(shè)計的銅(II)傳感功能。就熒光染料這一技術(shù)而言，人們已經(jīng)將其應(yīng)用于體內(nèi)pH、生命代謝產(chǎn)物和各種金屬離子的檢測等等，其檢測效果都十分突出，說明這項技術(shù)確實有著巨大的優(yōu)勢。 以上所提及的工作和研究都已一并附于附加材料的部分。
