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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 中藥鉤藤的分子生物學(xué)與化學(xué)鑒定
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本項(xiàng)目運(yùn)用rDNA ITS區(qū)序列測(cè)序分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的分子生物學(xué)方法，聯(lián)合HPLC—DAD技術(shù)與中藥色譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的化學(xué)分析方法，對(duì)鉤藤屬植物進(jìn)行準(zhǔn)確的種間鑒定。
- 詳細(xì)介紹：
- 鉤藤中藥材的化學(xué)成分研究表明，其主要有效成分為生物堿，但不同種的藥效成分有明顯的差別。目前，中藥鉤藤的分類鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和化學(xué)成分等傳統(tǒng)分析方法，由于這些方法的局限性，鉤藤中藥材在中藥市場(chǎng)上的分類鑒定比較混亂，在藥材使用上存在互混、互代、以次充好等現(xiàn)象，影響了用藥的安全性和有效性。 在DNA保存完整的情況下，對(duì)親緣關(guān)系相近的鉤藤屬植物進(jìn)行鑒別，DNA分子鑒定技術(shù)無(wú)疑是最直觀的方法。但是，加工炮制或萃取后的中藥材鉤藤核酸已被破壞，DNA 分子鑒定技術(shù)不適用于中藥材成品的鑒定。而化學(xué)成分分析方法可以很好地反映藥材成品的化學(xué)本質(zhì)，可根據(jù)鉤藤屬成品的化學(xué)成分及其含量的不同對(duì)其進(jìn)行種間鑒別。因此，聯(lián)合運(yùn)用分子生物學(xué)和化學(xué)成分分析技術(shù)進(jìn)行鉤藤屬不同種間的鑒定，既提高了鉤藤屬中藥鑒定的準(zhǔn)確度又?jǐn)U大了鑒定方法的適用范圍。 在分子生物學(xué)上，采用改良CTAB法提取鉤藤總DNA，并進(jìn)行rDNA ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，再連接到質(zhì)粒載體中，接著轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)過(guò)夜進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。最后將含鉤藤rDNA ITS區(qū)序列的克隆子進(jìn)行測(cè)序，得到的序列通過(guò)與國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的ITS區(qū)序列進(jìn)行比較分析，對(duì)鉤藤屬種間進(jìn)行鑒定。 在化學(xué)成分分析上，提取鉤藤屬樣品生物堿后采用高效液相色譜法分離有效生物堿，再以色譜聯(lián)用技術(shù)獲得鉤藤屬生物堿的色譜圖，并與對(duì)照品溶液（由已鑒定的鉤藤藥材制備）的色譜圖進(jìn)行對(duì)比分析以定性鑒別。最后用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)收集到的生物堿色譜圖和鉤藤對(duì)照藥材進(jìn)行比較，鑒定鉤藤屬藥材。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 聯(lián)合應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)和化學(xué)成分分析技術(shù)，對(duì)鉤藤屬種間進(jìn)行鑒定。在分子生物學(xué)上，用改良CTAB法提取鉤藤總DNA，并進(jìn)行rDNA ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增。經(jīng)克隆、測(cè)序后，運(yùn)用軟件進(jìn)行序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。在化學(xué)成分分析上，采用高效液相色譜法及色譜聯(lián)用技術(shù)獲得鉤藤樣品及對(duì)照品生物堿色譜圖。最后用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)收集到的生物堿色譜圖進(jìn)行比較分析，鑒定鉤藤屬藥材。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本作品結(jié)合rDNA ITS序列分析技術(shù)與化學(xué)成分分析技術(shù)，對(duì)鉤藤屬種間進(jìn)行鑒定。而且，對(duì)其不同種間進(jìn)行鑒定的研究還很少。因此，本作品在方法和在內(nèi)容上都具有獨(dú)特之處。方法上，聯(lián)合運(yùn)用以上兩種方法，既提高了鑒定的準(zhǔn)確度又?jǐn)U大了方法的適用范圍；內(nèi)容上，雖然鉤藤屬中藥具有較高的藥用價(jià)值，但相應(yīng)鑒定技術(shù)還不夠成熟，市場(chǎng)上以次充好現(xiàn)象較多，限制其推廣。本項(xiàng)目提供了更準(zhǔn)確全面的鑒定方法，將對(duì)其推廣有積極作用。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 針對(duì)鉤藤中藥材在中藥市場(chǎng)上的分類鑒定比較混亂，本研究小組聯(lián)合運(yùn)用分子生物學(xué)和化學(xué)成分分析技術(shù)進(jìn)一步對(duì)鉤藤屬種間進(jìn)行鑒定，能夠解決鉤藤屬中藥材在使用上存在的互混、互代、以次充好等現(xiàn)象，提高用藥的安全性和有效性。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的 通過(guò)測(cè)定鉤藤屬植物核糖體轉(zhuǎn)錄間隔（rDNA ITS）序列和分析鉤藤的HPLC色譜圖，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行分類鑒定。 方法 1）通過(guò)改良CTAB法提取2010年《中國(guó)藥典》中記載的五種入藥鉤藤植物總DNA，利用通用引物對(duì)rDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將測(cè)序后得到的序列與國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的ITS區(qū)序列進(jìn)行比較分析。運(yùn)用Clustal X，BioEdit和PAUP等軟件進(jìn)行序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；2）以已鑒定的鉤藤對(duì)照品為參照，采用HPLC-DAD聯(lián)用技術(shù)，并應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）對(duì)收集到的生物堿色譜圖和購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所的鉤藤對(duì)照藥材進(jìn)行比較，以實(shí)現(xiàn)鉤藤屬種間的分類鑒定。 結(jié)果 1）獲得五種入藥鉤藤的rDNA ITS區(qū)的完整序列并構(gòu)建鉤藤屬植物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；2）獲得五種鉤藤的HPLC色譜圖譜及其與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度比較。 結(jié)論 通過(guò)rDNA ITS序列進(jìn)行序列測(cè)定，能夠?qū)︺^藤屬植物進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定，HPLC-DAD聯(lián)用技術(shù)則能快速地對(duì)鉤藤屬中藥材成品進(jìn)行鑒定。兩種方法互補(bǔ)，既提高了鉤藤屬中藥鑒定的準(zhǔn)確度又?jǐn)U大了鑒定方法的適用范圍。
獲獎(jiǎng)情況
- 1.獲得廣東藥學(xué)院2010年校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目立項(xiàng)資格； 2.2010年10月在國(guó)家核心期刊“中草藥”上發(fā)表論文：毛鉤藤和無(wú)柄果鉤藤的ITS序列分析研究； 3.2011年3月在國(guó)家核心期刊“中國(guó)中藥雜志”上發(fā)表實(shí)驗(yàn)論文：一種鉤藤屬植物的分子鑒定。
鑒定結(jié)果
- rDNA ITS區(qū)序列的測(cè)序分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的分子生物學(xué)方法，以及HPLC—DAD技術(shù)與中藥色譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的化學(xué)分析方法，能夠?qū)︺^藤屬植物進(jìn)行準(zhǔn)確的種間鑒定，為其鑒定和分類提供了科學(xué)理論依據(jù)。
參考文獻(xiàn)
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同類課題研究水平概述
- 鉤藤具有清熱平肝、息風(fēng)定驚之功效，用于治療風(fēng)熱頭痛、頭暈?zāi)垦５劝Y，為中醫(yī)兒科要藥和現(xiàn)代治療高血壓方劑中的常用藥材。目前，中藥鉤藤的分類鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和化學(xué)成分等傳統(tǒng)分析方法，由于這些方法的局限性，鉤藤中藥材在中藥市場(chǎng)上的分類鑒定比較混亂，影響了用藥的安全性和有效性。分子生物學(xué)技術(shù)已在藥用植物的分子系統(tǒng)發(fā)育分析中廣泛地應(yīng)用，但對(duì)鉤藤屬植物的資源調(diào)查和種間分子鑒定等基礎(chǔ)研究工作還少有報(bào)導(dǎo)，僅有陶剛曾對(duì)貴州中藥材鉤藤屬植物進(jìn)行分子鑒定并歸類到屬。近十年，國(guó)內(nèi)外鉤藤屬種間鑒定等調(diào)查研究方面的基礎(chǔ)工作還很少，國(guó)內(nèi)僅有不超過(guò)5篇關(guān)于中藥鉤藤鑒定研究的文獻(xiàn)，其中貴州省研究人員發(fā)表了鉤藤的有效成分、藥理活性、資源分布等方面的研究論文約3篇。這些研究現(xiàn)狀表明，當(dāng)前對(duì)中藥鉤藤屬植物的鑒定仍然缺乏深入的研究。所以，探索出更簡(jiǎn)單有效的方法來(lái)進(jìn)行鉤藤屬種間鑒定是迫切的。
