基本信息
- 項目名稱：
- 產(chǎn)綠原酸金銀花內生菌的分離研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 金銀花為河南重要的地道藥材，本作品以金銀花為實驗材料，對其根、莖、葉、花不同組織器官的內生菌進行分離、純化；通過TLC、HPLC等方法對篩選出的內生菌次生代謝產(chǎn)物進行分析，篩選出3株產(chǎn)綠原酸的菌株，對其進行形態(tài)學鑒定，對篩選的高產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化選擇，并對菌株發(fā)酵液進行抑菌學實驗。為金銀花活性成分-綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
- 詳細介紹：
- 選取健康金銀花植株的不同組織部位(新鮮根、莖、葉、花)作為內生菌分離實驗材料，用平板劃線法，點植法進行分離。實驗過程中設有對照：吸取少量表面消毒中最后一次沖洗材料的無菌水，涂布于培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)如無微生物長出，表明表面消毒徹底，分離到的是內生菌。經(jīng)過反復分離、篩選、純化出了107株內生菌，其后用菌落觀察和鏡檢的方法去除重復，最終得到86株內生菌。對86株內生菌進行發(fā)酵后，用TLC法進行檢測，結果顯示次生代謝產(chǎn)物與綠原酸比移值相同的菌株有三株。為了確定這些次生代謝產(chǎn)物是否是含綠原酸，本次實驗研究進一步用HPLC法對其進行檢查，檢測結果與TLC法結果一致。其后以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌為指示菌，通過瓊脂擴散法對菌株抑菌活性進行研究，實驗結果得出，菌株對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌具有較強的抑菌活性，抑菌效果與金銀花藥材基本相同，而對大腸桿菌則表現(xiàn)出較弱的抑菌活性。利用形態(tài)比較法對菌落、菌絲體、孢子形態(tài)特征的認真觀察分析，鑒定3株產(chǎn)綠原酸菌株，分別為毛霉屬、曲霉屬、青霉屬。為了提高內生菌產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的效率，對內生菌二次發(fā)酵的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化即：碳源、氮源以及培養(yǎng)溫度進一步做了考察，最終確定最適培養(yǎng)條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28℃，120r/min，震蕩培養(yǎng)72小時。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 利用金銀花內生菌的多樣性，篩選出能產(chǎn)生金銀花主要活性成分綠原酸的菌株，利用其進行微生物發(fā)酵來生產(chǎn)其主要活性成分，為人類突破植物資源周期長、產(chǎn)量低、不可再生等限制。本研究通過分離金銀花到產(chǎn)綠原酸的菌株，并對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，為今后利用金銀花內生菌工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)綠原酸提供科學理論依據(jù)，具有很大的經(jīng)濟價值和研究意義。
科學性、先進性及獨特之處
- 經(jīng)文獻檢索，尚無發(fā)現(xiàn)有學者對金銀花內生菌及次生代謝產(chǎn)物進行研究，首次從金銀花中篩選出3株產(chǎn)金銀花綠原酸的菌株，并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，篩選出最佳發(fā)酵條件。對3株篩選的菌種發(fā)酵液與金銀花進行了抑菌對比試驗，抑菌效果與藥材效果基本相同。為金銀花綠原酸發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 基于目前金銀花的生產(chǎn)和需求現(xiàn)狀，利用其內生菌次生代謝產(chǎn)物來進行微生物發(fā)酵生產(chǎn)，生產(chǎn)其主要活性成分綠原酸，有助于人類突破植物資源周期長、產(chǎn)量低、不可再生等因素限制。利用內生菌進行發(fā)酵生產(chǎn)藥物及生物防治能有效減緩當前藥用植物資源逐漸短缺及環(huán)境污染日益嚴重的情況。
學術論文摘要
- 目的：通過對金銀花不同組織器官內生真菌的分離，篩選能產(chǎn)生綠原酸的菌株，通過菌株的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得高產(chǎn)綠原酸的發(fā)酵菌株及培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。方法：從金銀花不同組織器官中分離內生真菌，通過分離純化，對其發(fā)酵產(chǎn)物進行TLC和HPLC分析，同時利用顯微觀察法對其進行形態(tài)學鑒定，對篩選的高產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化選擇，并對菌株發(fā)酵液進行抑菌學實驗。結果：從金銀花中分離篩選到三株純化的的內生真菌，其濃縮發(fā)酵液與對照品有相同的遷移率，保留時間與對照品保留時間一致，結果表明，三株純化內生真菌能產(chǎn)生綠原酸，分別屬于青霉屬，毛霉屬，絲胞綱曲霉屬。經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28℃,120r/min，震蕩培養(yǎng)72小時。結論：金銀花不同器官中具豐富的內生菌，并有可產(chǎn)生與宿主相同的活性成分綠原酸，純化的產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵液具有明顯的與金銀花相同的抑菌效果。
獲獎情況
- 2011年河南省第九屆“挑戰(zhàn)杯”大學生課外學術科技作品省級競賽特等獎；2011年河南中醫(yī)學院第四屆“挑戰(zhàn)杯”大學生課外學術科技作品校級競賽二等獎
鑒定結果
- 無
參考文獻
- [1]項勇，崔京霞，呂安國．東北紅豆杉內生真菌的分離和篩選[J]．東北林業(yè)大學學報，2002，30(3)：30-34． [2]馬天有，董兆麟．植物分離產(chǎn)紫杉醇的內生真菌的研究[J]．西北大學學報，1999．29(1)：47-49． [3] 項勇，崔京霞.東北紅豆杉內生真菌的研究[J],東北林業(yè)大學學報 ，2002,30（2）：30-34 [4]李海燕．一種桃兒七內生真菌的分離初報．云南大學學報，1999，21(3):243 [5]一株產(chǎn)鬼臼毒素內生真菌發(fā)酵條件的研究[J].西北大學學報 [6]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:上?？茖W技術出版社,1979.
同類課題研究水平概述
- 研究發(fā)現(xiàn)某些內生菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或類似的產(chǎn)物，這一發(fā)現(xiàn)可能在一定程度上解決了某些藥物來源短缺的問題。近年來先后從紅豆杉（Taxus），長春花等藥用植物中分離得到了內生真菌，并從這些藥用植物內生真菌中分離得到了和宿主植物研究相同或相似的活性成分。內生菌作為許多重要藥用成分的新來源，可工業(yè)化生產(chǎn)而不受土壤氣候以及資源的限制，從而緩解了藥源的短缺。目前已經(jīng)從紅豆杉、長春花、銀杏等植物中分離出能產(chǎn)生活性成分的內生真菌[1,2,3]。 1993年Stiede首次從短葉紅豆杉(Taxus breviflia)中分離得到一株能合成抗癌物質紫杉醇的內生真菌(Taxomyces andreanae)，此后對東北紅豆杉也進行了研究[3]。云南大學張玲琪等從桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum）的莖中分離到能夠產(chǎn)生鬼臼毒素的內生真菌[4,5,6]。從長春花植株中分離出21株真菌，其中有4 株能夠產(chǎn)生長春新堿類似物，它們分別屬于鐮刀菌屬、交鏈孢屬和無孢菌群等， 從桃兒七植株中共分離得到28株真菌，其中有兩株能夠產(chǎn)生鬼臼毒素類似物，它們分別屬于青霉屬和交鏈孢屬。1999年，中山大學王偉等人從南方紅豆杉(Tchinensis var．mairei)中分離得到87株內生真菌，其中有6個菌株能分泌紫杉烷類化合物，它們分別屬于頭孢霉屬、輪柄梳霉屬和無孢菌群等。通過比較發(fā)現(xiàn)， 以上產(chǎn)生與宿主相同或相似生理活性成分的內生真菌菌株之間并不存在種屬聯(lián)系，表明內生菌具備這一能力并不是偶然現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)掀起了一場從藥用植物中分離內生菌的熱潮，為人類解決某些藥用植物生長緩慢、資源短缺等問題提供了新思路。
