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基本信息
- 項(xiàng)目名稱(chēng)：
- As（III）氧化菌篩選、鑒定與氧化機(jī)理分析
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類(lèi)：
- 生命科學(xué)
- 大類(lèi)：
- 自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文
- 簡(jiǎn)介：
- 砷導(dǎo)致農(nóng)田環(huán)境污染，危害人類(lèi)健康。如何有效降低土壤中砷的危害，成為熱點(diǎn)問(wèn)題之一。本研究通過(guò)高濃度砷定向誘導(dǎo)，篩選高砷環(huán)境下可生存的優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)富集培養(yǎng)及解砷效能驗(yàn)證，尋找能有效降低砷毒害的微生物，從而獲得一株具較強(qiáng)砷氧化能力菌株，并證明其能夠有效減輕水稻受砷毒害，同時(shí)運(yùn)用差異蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)該菌株的氧化As（III）機(jī)理進(jìn)行了初步探討。
- 詳細(xì)介紹：
- 采用定向誘導(dǎo)技術(shù)，從高砷污染的稻田土壤中篩選、純化、培養(yǎng)砷氧化菌并對(duì)其砷氧化能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，獲得了一株可將高毒性As(III)氧化為低毒性As(V)的高效菌株；研究了該菌株的最適培養(yǎng)條件，對(duì)菌株的形態(tài)特征進(jìn)行了觀察，采用16S rDNA和T-RFLP技術(shù)對(duì)該菌株進(jìn)行了分子鑒定。在水培條件下對(duì)該菌株減輕水稻受砷毒害的能力進(jìn)行了驗(yàn)證；進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)初步探討了該菌株在氧化砷過(guò)程中細(xì)菌胞內(nèi)、胞外蛋白質(zhì)差異表達(dá)。結(jié)果總結(jié)如下： 通過(guò)篩選，獲得一株能將高毒性As(III)氧化為低毒性As(V)的菌株并命名為CRS003；該菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：以4-羥基苯甲酸為碳源，以蛋白胨為氮源，pH值8，溫度25℃時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速128 rpm。在上述培養(yǎng)條件下，該菌株在24h內(nèi)可將培養(yǎng)液中95%的As(III)轉(zhuǎn)化為As(V)和少量的甲基砷（MMA）。菌株CRS003為革蘭氏陰性菌（弱陽(yáng)性），桿菌，無(wú)鞭毛；菌株CRS003的分子鑒定結(jié)果顯示，其序列同源性與Brevibacillus sp.達(dá)到100%。菌株CRS003的T-RFLP片段的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明，該菌株為Brevibacillus laterosporus。 在含As(III)的水培溶液中種植水稻（明恢63、雜交稻汕優(yōu)63、特優(yōu)航II），驗(yàn)證結(jié)果表明，菌株CRS003有效減輕了As(III)對(duì)水稻秧苗的生長(zhǎng)的影響。與對(duì)照（無(wú)As(III)無(wú)菌株菌液之培養(yǎng)液）相比，未添加菌株CRS003的菌液時(shí)，As(III)對(duì)三種水稻根長(zhǎng)的抑制率分別為50.37%、56.39%、54.61%，對(duì)株高的抑制率分別為43.31%、43.97%、41.07%。而當(dāng)添加了菌株CRS003的菌液后，As(III)對(duì)三種水稻秧苗根長(zhǎng)的抑制率分別降低到22.57%、11.47%、18.20%，株高的抑制率分別降低到21.91%、11.39%、17.83%。 在氧化砷的過(guò)程中，該菌株的胞內(nèi)、胞外蛋白質(zhì)差異表達(dá)結(jié)果表明，胞外則檢測(cè)出6個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生上調(diào)表達(dá)，胞內(nèi)檢測(cè)出33個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生上調(diào)表達(dá)，表明菌株以胞內(nèi)蛋白質(zhì)變化為主來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)As(III)的氧化作用。蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，5個(gè)胞外蛋白質(zhì)和27個(gè)胞內(nèi)蛋白質(zhì)獲得功能鑒定，對(duì)32個(gè)相應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)活性位點(diǎn)分析及功能查詢(xún)后，胞外蛋白質(zhì)涉及離子轉(zhuǎn)運(yùn)及信號(hào)激發(fā)等相關(guān)功能，而胞內(nèi)蛋白質(zhì)則涉及能量代謝及砷解毒等功能。因此通過(guò)對(duì)查詢(xún)到的蛋白質(zhì)進(jìn)行圖譜構(gòu)建，提出了As(III)在該菌株胞內(nèi)胞外的傳輸過(guò)程與解毒機(jī)理。
作品圖片
作品專(zhuān)業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 砷對(duì)作物和人類(lèi)健康具有毒害作用。如何有效降低土壤中砷的危害，成為各國(guó)政府和科研人員高度關(guān)注的問(wèn)題之一。微生物降解重金屬污染是生物修復(fù)的方法之一。該項(xiàng)目從稻田土壤中篩選出了一株砷氧化菌，分析了其砷氧化能力，獲得了最適培養(yǎng)條件，觀察了形態(tài)特征，進(jìn)行了分子鑒定，并驗(yàn)證了其解砷毒害的能力，探討了該菌株在氧化砷過(guò)程中，細(xì)菌胞內(nèi)、胞外蛋白質(zhì)差異表達(dá)，提出了該菌株氧化As（III）機(jī)理的假設(shè)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 將高毒性As(III)氧化為As(V)及甲基砷，是降低砷對(duì)作物和人類(lèi)毒害的有效方法。通過(guò)高濃度砷定向誘導(dǎo)，篩選高砷環(huán)境下可生存的優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)富集培養(yǎng)及解砷效能驗(yàn)證，尋找能有效降低砷毒害的微生物。研究思路清晰，技術(shù)方法合理。獲得一株具較強(qiáng)砷氧化能力菌株側(cè)胞短芽孢桿菌，并證明其能夠有效減輕水稻受砷毒害，運(yùn)用差異蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)該菌株的氧化As（III）機(jī)理進(jìn)行了初步探討。項(xiàng)目方案科學(xué)性強(qiáng)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 砷導(dǎo)致農(nóng)田環(huán)境污染，經(jīng)食物鏈傳遞到動(dòng)物和人體，危害人類(lèi)健康，因此如何有效降低土壤中砷的危害，成為各國(guó)政府和科研人員高度關(guān)注的問(wèn)題之一。 微生物降解重金屬污染是生物修復(fù)的方法之一，微生物修復(fù)技術(shù)直接在污染環(huán)境中開(kāi)展生物修復(fù)，簡(jiǎn)便易行。該項(xiàng)目針對(duì)我國(guó)砷污染問(wèn)題，通過(guò)篩選高氧化能力微生物菌株，切斷砷從土壤到作物的傳遞鏈，有效降低砷對(duì)作物及人類(lèi)危害。項(xiàng)目選題具重要科學(xué)意義及應(yīng)用價(jià)值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 采用定向誘導(dǎo)技術(shù)，從高砷污染的稻田土中篩選、純化及培養(yǎng)砷氧化菌并對(duì)其砷氧化能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，獲得了一株可將高毒性的As(III)氧化為低毒性的As(V)的高效菌株，并命名為CRS003。隨后研究了該菌株的最適培養(yǎng)條件，即當(dāng)以4-羥基苯甲酸為碳源，蛋白胨為氮源，pH值8，溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速128rpm時(shí)，該菌株在24h內(nèi)可將培養(yǎng)液中95%的As(III)轉(zhuǎn)化為As(V)和少量的甲基砷（MMA）。觀察菌株的形態(tài)特征，該菌株為革蘭氏陰性菌（弱陽(yáng)性），呈桿狀，桿菌，無(wú)鞭毛。進(jìn)行分子鑒定后，其序列同源性與Brevibacillus sp.達(dá)100%，為Brevibacillus laterosporus。在含As(III)的水培溶液中種植水稻，驗(yàn)證結(jié)果表明，菌株CRS003能有效減輕As(III)對(duì)水稻秧苗的生長(zhǎng)影響。 進(jìn)一步運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討了該菌株在氧化As(III)過(guò)程中胞內(nèi)、外蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。經(jīng)蛋白質(zhì)質(zhì)譜功能鑒定、結(jié)構(gòu)活性位點(diǎn)分析及功能查詢(xún)后，胞外蛋白質(zhì)涉及離子轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)激發(fā)等相關(guān)功能，而胞內(nèi)蛋白質(zhì)則涉及能量代謝和砷解毒等功能。通過(guò)構(gòu)建已查詢(xún)蛋白質(zhì)的圖譜，推斷了As(III)在該菌株胞內(nèi)外的傳輸與解毒過(guò)程。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- 參考技術(shù)： 1、末端限制性長(zhǎng)度多肽性分析（T-RFLP）；2、毛細(xì)管電泳 - 電感耦合等離子體譜聯(lián)用儀（CE-ICP-MS）；3、雙向電泳（2-DE） 參考文獻(xiàn)： [1]陳德富, 陳喜文. 現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù). 北京:科學(xué)出版社. 2006:96-98. [2]GuiDi Yang, JinHua Xu, JinPing Zheng, et al. Speciation analysis of arsenic in Mya arenaria Linnaeus and Shrimp with capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry. Talanta. 2009,78:471-476. [3]陸錦池, 王海斌, 陳榮山, 等. 化感水稻PI312777響應(yīng)低磷脅迫的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2009,25(14):148-152. [4]Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, et al. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Analytial Chemistry. 1996,68(5):850-858.
同類(lèi)課題研究水平概述
- 近年來(lái)，隨著煤礦能源的大量無(wú)序開(kāi)采，廢水、廢渣的大量排放，加上含重金屬農(nóng)藥、除草劑以及化肥等化學(xué)產(chǎn)品的大量施用，重金屬污染已成為了一個(gè)世界性環(huán)境問(wèn)題。因此，有效治理土壤砷污染已經(jīng)成為各國(guó)政府及研究人員日益重視的問(wèn)題。2011年3月，國(guó)務(wù)院已批準(zhǔn)《湘江流域重金屬污染治理實(shí)施方案》，未來(lái)治污資金總額將達(dá)595億元，可見(jiàn)重金屬污染治理問(wèn)題已經(jīng)勢(shì)在必行。 砷雖不屬于重金屬，但行為、來(lái)源以及危害都與重金屬相似，故通常列入重金屬類(lèi)進(jìn)行討論。首例As(III)氧化細(xì)菌于1918年由Green H報(bào)道。隨著研究的不斷進(jìn)展，越來(lái)越多As(III)氧化菌被發(fā)現(xiàn)，研究較多的典型菌株包括：Alcaligenes faecalis NCIB 8687、Rhizobium sp.NT-26、Agrobacterium tumefaciens 5A、Herminiimonas arsenicoxydans ULPAsl、Thiomonas sp.3As，這些菌株都能夠?qū)⒍拘詮?qiáng)的As(III)氧化為毒性弱的As(V)。 在生物體內(nèi)砷代謝包括兩個(gè)主要過(guò)程：（1）As(V)的還原過(guò)程；（2）無(wú)機(jī)砷的甲基化過(guò)程。微生物對(duì)環(huán)境中砷的氧化還原轉(zhuǎn)化及甲基化和去甲基化等起主導(dǎo)作用, 微生物砷代謝在砷的動(dòng)態(tài)循環(huán)起重要作用。國(guó)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了一株細(xì)菌C13能在有氧條件下將As(III)氧化為As(V)，并鑒定了該菌株為土壤桿菌，同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)菌C8、C14，能將As(V)還原為As(III)，被鑒定為節(jié)桿菌、貪銅菌。“ars”砷離子泵作為研究比較透徹的一條解毒路徑，含有該離子泵的微生物可將As(V)還原成As(III)，并在ATP酶、As(III)運(yùn)輸酶作用下把As(III)排出胞外，進(jìn)而達(dá)到降解As(III)毒害的目的。 盡管砷氧化菌株篩選已取得重大進(jìn)展，然而大部分僅限于氧化能力評(píng)價(jià)，特別是當(dāng)前篩選的砷氧化菌在氧化能力評(píng)價(jià)上受限于儀器分析的靈敏度，一般只是對(duì)氧化As(III)、As(V)含量分析，并未涉及甲基化，更重要的是其氧化機(jī)理的揭示并沒(méi)有明確的結(jié)論。因此，本研究從解As(III)毒的細(xì)菌篩選，并對(duì)解毒能力做了初步驗(yàn)證，具有較好的應(yīng)用價(jià)值，而且As(III)與菌株蛋白的相互作用結(jié)果，為解析重金屬離子與蛋白相互作用，進(jìn)而分析As(III)轉(zhuǎn)化與解毒機(jī)理，具有重大的實(shí)際意義。
